水及食品中微生物的检测
水及食品微生物检验方法为食品监测必不可少的重要组成部分。它不仅是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否食用的科学依据之一。通过食品微生物检验，可以判断食品加工环境及食品卫生环境,能够对食品被细菌污染的程度作出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据,提供传染病和人类，动物和食物中毒的防治措施[1]。食品微生物检验是以贯彻“预防为主”的卫生方针，可以有效地防止或者减少食物中毒人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；同时，它对提高产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有政治上和经济上的重要意义。
细菌总数是指被检样品经过处理（如剪碎、研匀），在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落的总数。由于一个活细胞能形成一个菌落，因此，菌落就是待测样品所含的活菌数。由于每种细菌都有一定的生理要求（如对氧、培养温度、培养基的pH等），所以，培养时应该用不同的培养条件及不同的生理条件去满足其要求，才能将各种细菌都培养出来，从而检测菌数总量。
大肠菌群是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。食品中检出大肠菌群，表明该食品有污染，可能存在肠道致病菌。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。大肠杆菌在外界存货时间与一些肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌 [2]。
本实验主要通过MPN检验法，伊红美蓝选择性分离鉴别和革兰氏染色的检验法对湖水及黄酒中大肠杆菌总数的测定并且判断阴阳性，掌握水及食品中大肠杆菌的检测方法[3]。 1.材料与方法 1.1材料
样品：湖水、黄酒。 培养基及试剂
①肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏0.5g、蛋白胨1.0g、NaCl0.5g、水100ml、pH7.2、0.10Mpa 灭菌20min。
②乳糖胆盐发酵培养基：蛋白胨4g、乳糖2g、猪胆盐1g、0.04%溴甲酚紫水溶液2~3滴、蒸馏水200ml、pH7.4。将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，矫正pH，加入指示剂，分装每18根，并倒置放入杜氏小管。
③乳糖发酵培养基：蛋白胨2.4g、乳糖1.2g、0.04%溴甲酚紫水溶液2~3滴、蒸馏水120ml、
pH7.4、分装10根。并倒置放入杜氏小管。 ④伊红美蓝固体培养基。
⑤12根9ml/根无菌水、1ml移液管15根。 实验仪器
显微镜、培养基、水浴锅、培养皿、吸管、接种环、试管、杜氏小管、涂布器、酒精灯、试管架等。 1.2方法
1.2.1细菌总数的测定 ①采样：样品采用湖水和黄酒
②检样稀释：用1ml移液管吸取原液1ml沿管壁慢慢注入含有9ml蒸馏水的试管内，制成10-1浓度的稀释液，再以此方法依次制成10-2、10-3、10-4、10-5稀释液。
③倾注培养：选择10-4、10-5两个稀释度的试管分别取1ml悬浮液放置于肉膏蛋白胨培养皿，并摇动培养皿使培养基和菌液混匀，每个稀释度重复接2个平板，待凝固后将平皿倒置于36±1℃培养箱内培养24小时。 ④菌落计数：可用肉眼观察计数。 1.2.2大肠菌群检验
①乳糖胆盐发酵：选择原液、10-1、10-2共3个浓度的稀释液，分别取1ml接种到乳糖胆盐发酵管中，每个稀释度接种3管，置于36±1℃培养箱内培养24小时。若都不产气，则大肠菌群为阴性，如有产气管，进行分离培养。
②分离培养：把产气的发酵管分别接种再伊红美蓝琼脂平板上，置于36±1℃培养箱内培养24小时，观察菌落形态，进行革兰氏染色。
③复发酵证实实验：在伊红美蓝琼脂平板上挑选紫红色带有金属光泽的菌落，挑选1个菌落接种到乳糖发酵管内进行复发酵，置于36±1℃培养箱内培养24小时。同时对应这个菌落进行革兰氏染色。
④革兰氏染色：涂片→初染：结晶紫染色1min→水冲洗→碘液媒染1min→水洗→用95%酒精脱色→水洗→蕃红染色10s，水洗→镜检。 2.结果与分析 2.1细菌总数的测定：
培养24小时后，经观察肉膏蛋白胨琼脂培养基中没有明显的菌落产生。 菌落总平均数<1×10个/ml。
培养基上未长出菌落，原因可能是在倾注培养时，肉膏蛋白胨培养基温度过高杀死了一部分大肠杆菌，或者培养条件不良造成菌群不能生长。黄酒中所测得的菌落数比较准确，由于黄酒经过加工灭菌，故其中大肠杆菌比较少[4]。 2.2大肠菌群的检测：
经培养后观察得接种有湖水的乳糖胆盐发酵管有产气，接种黄酒的乳糖胆盐发酵管没有产气，所以黄酒中大肠菌群为阴性。对湖水进行复发酵证实试验。 如图所示为复发酵实验结果： 稀释度 原液 管号 1 2 3 10-1 1 2 3 10-2 1 2 3 乳糖胆盐发酵 产气 产气 产气 不产气 不产气 产气 不产气 不产气 不产气 革兰氏染色 红色 红色 红色 红色 结论 大肠菌群阳性 大肠菌群阳性 大肠菌群阳性 大肠菌群阴性 大肠菌群阴性 大肠菌群阳性 大肠菌群阴性 大肠菌群阴性 大肠菌群阴性 根据上表和MPN检索表可得，大肠菌群最可能数为430个/100ml,即约4.3个/ml。 3.讨论
根据试验表明倾注培养平板计数得到的大肠杆菌数与复发酵证实试验所得的大肠杆菌数差异不大，可见，被检测湖水样品中大肠杆菌数比较少，但大多为阴性菌。并且接种黄酒的乳糖胆盐发酵管中没有产气，进一步可知该黄酒是合格的。在进行复发酵证实试验时，大肠菌群是带有金属光泽的菌落，要着重注意区分。 参考文献
[1]林文辉.浅谈食品微生物监测方法的进展[J].医药与卫生.2010,295-296.
[2]李艳霞,吴松浩.食品微生物监测技术的研究进展[J].食品工业科技.2008,29(7):270-272. [3]刘志皋.食品营养强化与营养增补[J]天津科技大学,2003-02-15 6 284.
[4]闰雪,姚卫蓉,钱和.国内外食品微生物检测技术的应用进展[J].食品科学.2005,6(26):269-271.