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13．比较原核生物和真核生物DNA复制的不同点。 共同点:
(1)DNA的半保留复制 即在DNA复制过程中.碱基间氢键首先断裂.双螺旋解旋和分开.每条链分别作为模板.按碱基配对原则合成其互补链.从而形成两个新的双链分子.因新形成的DNA分子中.各保留一条亲代的DNA单链.故名半保留复制.也因此保证了遗传信息的稳定性.此假说最先由Waston和Crick提出.后经Meselson.Stahl(1957)设计的氯化铯密度梯度离心实验.以及Taylor(1957).Cairns(1963)的放射自显影实验所证实.现已为大家所公认.成为原核生物和真核生物DNA复制的普遍规律.
(2)DNA的半不连续复制 1968年日本学者冈崎等提出了DNA半不连续复制的模型.后又用同位素标记技术.令人信服地解释了两条互补反向平行的DNA单链是如何同时作为模板进行复制的.他认为.在DNA复制过程中.一股模板上DNA的合成是连续的,另一模板上DNA链的合成是不连续的.是首先合成较短的DNA片段(即冈崎片断).然后再由连接酶连成大片段.同时.不连续合成的这条链总是落后于连续合成的那条链.称为滞后链,连续合成的链称为前导链.前导链前进的方向与复制叉前进方向相同,滞后链合成方向与复制叉前进方向相反.因此.DNA聚合酶的反应方向始终保持5′-3′.
(3)DNA复制的起始.延伸和终止 许多实验表明.DNA的半保留复制是从DNA分子的特定位点开始的.即复制原点(用ori或o表示).现已证明.除fd组噬菌体外.许多生物的复制原点都是富含A-T的区段.由于此区段的键能较低.易于形成瞬时单链.便于单链结合蛋白与之结合.
不同点:
1) 原核生物基因组DNA有1个复制子.真核生物有多个复制子 2) 原核生物比真核生物DNA复制速度快
3) 原核生物引物由引酶催化合成的.真核生物引物由DNA聚合酶α催化合成的 4) 原核生物与真核生物DNA聚合酶不同
5) 真核生物端粒DNA的合成由端粒酶催化合成的.原核生物不存在这种情况.
14．保证DNA复制忠实性和蛋白质翻译忠实性的因素分别有哪些？ ⑴DNA复制的复杂性保证了复制的高度忠实性。
E.coli复制时，每个碱基对错配频率为10-9~10-10，是高保真系统。
新DNA链合成时需引物，引物后又要切除，再以DNA链取代，DNA聚合酶在合成时还有校对功能，每引入一个核苷酸都要复查一次，未核实则不能继续进行聚合反应。
在复制过程中还有许多辅助蛋白，E.coli就至少有15种。复制叉的复杂结构进一步提高复制准确性。
DNA复制还存在正调控和负调控，调控分子可以是蛋白质，也可以是RNA。 ⑵保证蛋白质翻译忠实性的因素
①氨基酸活化成为氨基酰 -tRNA 的过程由氨基酰 -tRNA 合成酶催化，该酶对底物氨基酸和 tRNA 都有高度特异性，此外还有校正活性即将任何错误的氨基酰 -AMP-E 或氨基酰 -tRNA 的酯键水解，再换上与密码子相对应的氨基酸。这样使氨基酰 -tRNA 分子中 tRNA 的反密码子通过碱基配对识别 mRNA 分子上的密码子，使氨基酸按 mRNA 信息的指导“对号入座”，保证了从核酸到蛋白质的遗传信息传递的准确性。
②核糖体对氨基酰 -tRNA 的进位有校正作用。只有正确的氨基酰 -tRNA 能发生反密码子 - 密码子适当配对而进入 A 位。反之，错误的氨基酰 -tRNA 因反密码子 - 密码子配对不能及时发生而从 A 位解离。这是维持蛋白质生物合成的高度保真性的另一重要机制。
一．名词解释：
1、转录: 是指以DNA为模板，在依赖于DNA的RNA聚和酶催化下，以4中NTP（ATP、 CTP、GTP和UTP）为原料，合成RNA的过程。
2、转录单位: 从启动子到终止子称为转录单元 (transcription unit) (转录起始点) 3、模板链: 又称反义链, 指作为模板进行RNA转录的链
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4、编码链: 又称有义链, 指不作模板的DNA单链
5、转录泡：在转录时RNA聚合酶Ⅱ（RNAPⅡ）与DNA模板结合，会形成一个泡状结构，成为转录泡。
6、RNA聚合酶：以一条DNA链或RNA为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。是催化以DNA为模板（template）、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶。
7、C端结构域(CTD)：RNApolⅡ的大亚基中有 C 末端结构域。CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复Tyr－Ser－Pro－Thr－Ser－Pro－SerC 端重复七肽。
8、启动子: 是指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域，它还包括一些调节蛋白因子的结合位点
9、上游：转录起点上游的序列，是调控区，与转录的方向相反。 10、下游：转录起点下游的区域，是编码区，与转录的方向一致。
11、转录起点：＋1位点，RNA聚合酶的转录起始位点，起始NTP多为ATP或GTP。 12、转录泡：RNApol 结合和转录的DNA模板区域，有17bp左右DNA形成解链区。 13、三元转录复合物：由RNA聚合酶，DNA模板和一小段转录产物RNA构成的转录泡复合物。
14、核心启动子：RNA聚合酶能够直接识别并结合的启动子。
15、上游激活序列(UAS)：TATA框上游的保守序列称为上游启动子元件或上游激活序列。 16、终止子（terminator）：在转录的过程中，提供转录终止信号的RNA序列。
17、抗终止子：有的蛋白因子能作用于终止序列，减弱或取消终止子的作用，称为抗终止作用，这种蛋白因子就称为抗终止因子。/引起抗终止作用的蛋白质。
18、hnRNA：核内不均一RNA，是存在于真核细胞核中的不稳定，大小不均一的一组高分子RNA的总称。
１９、选择性剪接：一个hnRNA（pre-mRNA）转录本，通过外显子的剪、接、重组，产生多个成熟的mRNA的机制。
20、组成性剪接：一个基因的转录产物通过剪接只能产生一种成熟的mRNA.它和选择型剪接的区别是后者可以产生多种成熟mRNA。
21、GU-AG规则：这是一条与真核生物蛋白质编码基因相关的规则，说的是 RNA 内含子序列 5' 端 的起始两个核苷酸总是 5'-GU-3' ，并且其 3' 端 的最后两个核苷酸总是 5'-AG-3'
22、剪接体：在剪接过程中形成的剪接复合物称为剪接体,剪接体的主要组成是蛋白质和小分子的核RNA(snRNA)。复合物的沉降系数约为50～60S,它是在剪接过程的各个阶段随着snRNA的加入而形成的。
2. 说明RNApol全酶各个亚基的主要功能。 （1） σ 亚基：转录起始时与核心酶结合全酶。使全酶能识别启动子的Sextama Box(－35区),并通过σ与模板链结合。不同的σ因子与核心酶结合，可识别不同的启动子。
（2）α亚基：核心酶的组建因子 ，促使RNApol 与DNA模板链结合 前端α因子－－使模板DNA双链解链为单链
尾端α因子－－使解链的单链DNA重新聚合为双链 （3） β亚基：DNA/RNA杂交链结合位点 ? 完成NMP之间的磷酸酯键的连接
? 编辑功能（排斥与模板链不互补的碱基） ? 与Rho （ρ）因子竞争RNA 3’－end ? 构成全酶后，β因子含有两个位点：
I site（initiation site. Rifs）:该位点专一性地结合ATP或者GTP （需要高浓度的ATP或GTP）
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E site（elongation site RifR）:对NTP非专一性地结合（催化作用和Editing功能）
（4） β’ 亚基：参与RNA非模板链的结合，保护作用。 （5） w 亚基：在全酶中存在，功能不清楚。 五、问答题
1. 简述转录的基本过程?
答：⑴全酶与启动子结合的封闭型启动子复合物的形成（ R位点被σ因子发现并结合 ） ⑵开放型启动子复合物的形成：
①RNApol的一个适合位点到达－10序列区域，诱导富含A·T的Pribnow 框的“熔解”， 形成12－17bp的泡状物，同时酶分子向－10序列转移并与之牢固结合
②开放型启动子复合物使RNApol聚合酶定向 ③两种复合物均为二元复合物（全酶和DNA ）
⑶在开放型的启动子复合物中，RNApol的I位点和E位点的核苷酸前体间形成第一个磷酸二酯键 （β亚基）；三元复合物形成； +1位多为CAT模式,位于离开保守T 6~9 个核苷酸处
⑷σ因子解离 →核心酶与DNA的亲和力下降起始过程结束→核心酶移动进入延伸过程 2.试比较原核和真核细胞的mRNA的异同. ⑴原核生物
①原核生物mRNA 的半衰期短。
②许多原核生物mRNA以多顺反子形式存在。
③其5’端无帽子结构，3’端没有或只有较短的poly(A)。 ④原核细胞mRNA（包括病毒）有时可以编码几个多肽。 ⑤原核生物常以AUG（有时GUG，甚至UUG）作为起始密码子 ⑵真核生物：
①其5’端存在帽子结构。
②绝大多数真核生物mRNA具有poly(A)尾巴。 ③其RNA最多只能编码一个多肽。
④真核生物几乎永远以AUG为起始密码子。
3. 以E.coli为例，说出Prok.启动子结构及各部分功能。 答：启动子由两个部分组成：
上游部分 — CAP-cAMP结合位点（基因表达调控的正控制位点） CAP：降解物基因活化蛋白，环腺苷酸（cAMP）的受体蛋白
下游部分 — RNApol的进入（结合）位点 ，－35 ~ －10，包括识别位点和结合位点 1） Sextama 框：-35序列，位于复制起点上游35个核苷酸处的6核苷酸序列，能被RNA聚合酶全酶识别并结合。其中，σ亚基在识别中起关键作用。
2） Pribonow 框：-10序列，位于-10处的6核苷酸序列（TATAAT），能使RNA聚合酶识别DNA双链中的反义链，确保转录的链和方向无误。
4．真核生物的RNA聚合酶是如何区分的?有几类? 分别转录哪些RNA? 根据对 α - 鹅膏蕈碱的敏感性不同而分三类：
RNApolⅠ：最不敏感（动、植、昆） RNApol Ⅱ：最敏感 RNApol Ⅲ：不同种类的敏感性不同
转录产物：
RNApolⅠ：核仁 活性所占比例最大 转录rRNA（5.8S、18S、 28S） RNApolⅡ：核质 主要负责 hnRNA、snRNA 的转录
hnRNA（mRNA 前体，核不均一RNA） snRNA（核内小分子 RNA ） RNApol Ⅲ：核质 负责 tRNA、5S rRNA、Alu序列和部分 snRNA
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5．真核生物-25 ~ -35区、-70 ~ -80区的保守序列分别是什么？
Sextama框 (Sextama Box),-35序列, 大多数启动子中共有序列为TTGACA CAAT框（CAAT box）：其一致顺序为GGGTCAATCT，是真核生物基因常有的调节区，位于转录起始点上游约-80-100bp处，可能也是RNA聚合酶的一个结合处，控制着转录起始的频率。
6．真核生物有几种启动子?
真核生物中有三种不同的RNA聚合酶，因此也有三种不同的启动子：RNA polⅠ启动子、RNA polⅡ启动子、RNA polⅢ启动子。
7．说明poly(A)在分子生物学实验中的应用价值。
a) 可将 oligo (dT) 与载体相连，从总体RNA中分离纯化mRNA b) 用寡聚dT（oligo (dT)）为引物，反转录合成 cDNA 8．Euk.mRNA帽子的种类。
帽子0 （Cap-0） m7GpppXpYp-------（共有）m7G N7—甲基鸟苷 帽子1 （Cap-1） m7GpppXmpYp--------第一个核苷酸的 2’-O 位上产生甲基化 （A N6 位甲基化）
帽子2（Cap-2） m7GpppXmpYmp第二个核苷酸的 2’-O 位上产生甲基化（A、G、C、U） 9．真核生物mRNA的3‘poly(A)的编码情况及其准确生成的机制为何？
大多数真核生物的mRNA 3'末端都有由100~200个A组成的Poly（A）尾巴。 生成：a、 RNA末端腺苷酸转移酶（poly(A) 聚合酶）催化前体－－ATP 反应如下： Mg++ 或 Mn++
多聚核糖核酸+nATP ————>多聚核糖核酸(A)n + nPPi b、添加位点
内切酶(360KDa)切除一段序列———> 由poly(A) 聚合酶催化添加poly(A) 内切酶的识别位点（有其它因子参与）
切点上游 13－20bp处的AAUAAA， 切点下游的 GUGUGUG （单细胞Euk.除外） 10．增强子最早在哪里发现?简述它的5个作用特点。
SV40的两个正向重复研究得最清楚（DR）,-107~ -178 、-179 ~ -250 ; 各 72bp . 该增强子的特点如下：
⑴对依赖于TATA框的转录的增强效应高于不依赖的情况 ⑵距离效应: 离72bp越近的容易起始转录 ⑶转录方向离开72bp的起始序列优先转录 ⑷细胞类型的选择：不同类型中作用有差异
11．剪接体由哪些成分组成？试述剪接过程中各组分的组装过程及其剪接机制。 剪接体：是以五个不同的小核核糖核酸以及不下于一百个蛋白质所组成的大型核糖核酸蛋白质复合物，称为小核核糖蛋白。
剪接体剪接及自剪接涉及两个步骤的生物化学过程。两个步骤均需要在RNA间进行转酯反应。但是tRNA剪接则没有交醋化/转酯化过程。
剪接体及自剪接交酯化反应的发生有特定的次序。首先，一个在内含子的特定“剪接分支位点”核苷酸会与这个内含子的第一个核苷酸产生转酯化反应，形成两个RNA分子，一个是“内含子套索”另一个则是内含子前的外显子。第二，第一个外显子最后的核苷酸会与第二个外显子的首个核苷酸产生转酯化反应，连接外显子并释放内含子套索。
12．真核生物mRNA前体内含子剪接的信号序列特征是什么？ mRNA前体中内含子的两端边界存在共同的序列，这些序列可能是产生mRNA前体剪接的信号。多数细胞核mRNA前体中内含子的5’边界序列为GU，3‘边界为AG。
13．剪接分支位点核苷酸是什么？ 腺嘌呤核糖核苷酸
14．什么是选择性剪接？说明选择性剪接在果蝇性别决定中的作用机制。
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选择性剪接是指透过对同一个基因转录的相同pre-mRNA使用不同的剪接选择，产生不同的mRNA异构物，最后产生多种相似却又独特的蛋白质，或是产生出稳定性低的mRNA产物以达到调节基因表现的目的。
15.I型内含子发生改变后，可以产生其他酶的活性吗?如果可以，是哪些活性?这意味着I型内含子的催化中心有什么特点？
答：可以。这些活性包括：RNA聚合酶、内切核酸酶、磷酸酶、连接酶的活性。将I 型内含子转变成这些酶的能力表明它能结合于RNA的糖—磷酸骨架并能催化在它前后的几个不同反应。例如，连接是剪切的相反反应。
16.转录涉及模板链和编码链的分离，解释在转录中单链DNA是怎样被保护的。
答： 转录过程中控板与编码链分离时，聚合酶覆盖了整个转录泡——从解旋位点到螺旋重新形成位点，因此单链的DNA被保护起来。与复制不同，转录不需要单链结合蛋白的参与。
17.哪三个序列对原核生物mRNA的精确转录是必不可少的?
答： -35(RNA聚合酶结合位点)、-10(RNA荣合酶起始位点)启动子序列和终止子； 18．原核生物与真核生物启动子的主要差别？ 原核生物
TTGACA --- TATAAT------起始位点 -35 -10 真核生物
增强子---GC ---CAAT----TATAA—5mGpp—起始位点 -110 -70 -25
19．一双链DNA分子如下图所示，在体内它编码五个氨基酸残基的多肽： 3’TAC ATG ATC ATT TCA CGG AAT TTC TAG CAT GTA5’ 5’ATG TAC TAG TAA AGT GCC TTA AAG ATC GTA CAT3’ 试问：（1）．哪条链是转录的模板链？
5’ATG TAC TAG TAA AGT GCC TTA AAG ATC GTA CAT3’ （2）．写出该五个氨基酸残基的多肽。 AUG CUA GAA AUU CCG (UGA) 分析：
5UAC AUG AUC AUU UCA CGG AAU UUC UAG CAU GUA3 3AUG UAC UAG UAA AGU GCC UUA AAG AUC GUA CAU5 12．试证明一个基因中只有一条DNA链作为模板被转录。
答：若基因两条链均被转录，而RNA聚合酶只能以5’ →3’方向合成，所以两条DNA链会以相反方向转录。两信使携带着彼此互补的反向核苷酸序列，编码不同的多肽。虽然某些DNA顺序能被双方向转录，但这不是常见现象。最早的明确证据是通过研究噬菌体SP8感染枯草杆菌(Bacillus subtilis)得到的。 SP8的DNA很特别：一条链(重链)富含嘌呤，另一链(轻链)则富含嘧啶。若把双链DNA温和加热，两条链分离(即DNA变性)，可用密度梯度离心分离两条链。 1963年，Julius Marmur和Paul Doty用SP8感染枯草杆菌细胞后提取RNA，发现它只能与噬菌体DNA的“重”链杂交(即互补配对形成DNA-RNA杂合分子)。而不会与轻链杂交。显而易见，信使只可以与一条DNA链(重链)互补，因而DNA双链中只有一条链作为转录的模板(图A7.8)。 Marmur和Doty很幸运地选用SP8做实验，因为它的全部基因都是同一条DNA链中转录而来。而另一些噬菌体，包括T4和λ噬菌体，部分基因由一条链转录而其他基因则由另一条链转录；因此若用这些噬菌体而不是SP8做实验，则不能成功地说明问题。
13．有一个被认为是mRNA的核苷酸序列，长300个碱基，你怎样才能： (1)证明此RNA是mRNA而不是tRNA或rRNA。 (2)确定它是真核还是原核mRNA。
答：根据序列组成进行判断： (1)此序列太长不可能是tRNA。如果它是rRNA，应该含有许多特殊元件，如：假 尿嘧啶和5—甲基胞嘧啶； 同时应具有可以形成发夹环的反向重复序
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