㈤渐增切割法产生杂和酶
尽管DNA shuffling介导的重组已成为定向进化创建高质量序列多样性的重要工具，但它们通常不能用于重组同源性低于70%~80%的序列。而自然界大多数同源序列具有比这个数目低得多的相似性。为了解决这个问题，Benkovic研究组建立了渐增切割法产生杂和酶（incremental truncation for the creation of hybrid enzymes，ITCHY）及Thio-ITCHY（α-硫代磷酸核苷酸介导的ITCHY）方法来产生不依赖于DNA序列同源性的重组文库。ITCHY的基本原理是：控制核酸外切酶#的切割速度不大于10碱基／min，然后间隔很短时间连续取样终止反应，以获得一组依次有一个碱基缺失的片段库；然后将基因A的一组随机长度的5’端片段与基因B的一组随机长度的3’端片段随机融合产生杂合基因文库。但由于该方案冗长繁琐，Lutz等又提出了Thio-ITCHY方法：首先将待PCR反应或单链模板引伸反应将α-硫代磷酸核苷酸随机引入产物中，由于其抗核酸外切酶Ⅲ的切割，接下来的切割反应会在此处随机终止，连接切割产物即产生随机交叉文库.该法操作便利，同时也可引入随机点突变。此外，ITCHY/Thio-ITCHY不依赖DNA序列同源性，可在非序列同一区内产生活性融合子。迭代ITCHY或对其文库进行shuffling还可以创造多个交叉。
㈥不依赖序列同源性的蛋白质重组
尽管上述ITCHY可以进行不依赖于序列同源性的重组，但它是一个随机长度片段与另一个随机长度片段相融合，结果文库中基因长度不再保守，子代中功能杂合子的比率很低。要想提高功能杂合子所占比例，须使交叉发生在具有相似结构环境的位置，但由于缺乏足够的序列相似性，同源重组不能发挥作用，因此Sieber等提出了不依赖序列同源性的蛋白质重组（sequence
homology-independent protein recombination，SHIPREC）方法：通过琼脂糖凝胶电泳回收单基因长度随机片段，保证了子代嵌合体长度的保守性，使交叉保持了适当的序列匹配，主要发生在结构上相关的位点，交叉点处的两个氨基酸仍处于它们在亲本蛋白质结构中的位置，从而提高了文库中阳性克隆的比例。该法可以在低序列同一性甚至无序列同一性的同源蛋白质间创造具有单交叉的杂合蛋白质组合文库。迭代SHIPREC可以产生多个交叉。
随着酶分子定向进化的发展，在常规的定向进化方法的基础上，又相继开发出另一些新方法，如设计的寡核苷酸装配(assembly of designed oligonucleotides，ADO)、诱变和单向重组(mutagenic and unidirectional reassembly，MURA)、随机插入-删除链交换突变(random insertional deletional strand exchange mutagenesis，RAISE)、基于Y连接的构件改组(Y-ligation-based block shuffling，YLBS)、合成改组(synthetic shuffling)等新方法都有改造蛋白的成功案例，也为更好的进行定向进化提供了强有力的工具和指导思想。
三、文库筛选策略
一旦多样性文库构建好后，定向进化实验成败与否的关键则在于“要有针对目的改造特征的高效筛选方案”。近几年，与创建多样性重组文库的发展相适应，在高流通量和超高流通量筛选技术方面也取得另人瞩目的成就。其中核糖体展示技术与mRNA展示技术，由于在体外无细胞翻译体系中进行，不受细胞转化效率的限制，大大提高了文库容量和筛选通量（1012~1014）。它们的原理是通过筛选靶蛋白-核糖体-mRNA三元复合物或靶蛋白-mRNA二元复合物，将基因型与表型直接偶联起来，并利用mRNA的可复制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集。利用此法进化单链抗体可变区scFv片段，获得
亲和力提高40倍的变异株。
其他高通量筛选方法，如细胞表面展示技术和噬菌体表面展示技术；将靶活力与转录信号相偶联的三杂交体系；以发光信号为指示的反射增进系统；利用荧光信号的荧光共振能量转换仪（FRET），结合荧光激活细胞筛选仪（FACS），每小时可筛选60000个细胞。最近Chadessy等还报道了一种隔室化自复制技术，通过一个只复制其自身基因的聚合酶组成的简单反馈环将体外进化与筛选有机结合起来，使阳性克隆得到快速、高效的富集，获得热稳定性提高11倍，肝素抗性提高130多倍的Taq DNA聚合酶突变株。
在硬件设备方面，1536和3456孔板以及多通道多波长检测仪的出现、每秒钟分配几千滴皮升级样品的非接触式压电配样仪的问世等都大大提高了样品处理速度。
定向进化的意义
定向进化不仅在工业、医疗方面对蛋白质的改造具有重要的意义，而且，它也非常适合于基础理论的研究。对蛋白质分子进化得到的突变体进行分析，为研究蛋白质的结构和功能的关系提供了新的工具。天然蛋白质序列中往往有很多是随机遗传漂移，而不是功能性的适应。例如，从适应不同环境的物种中提取出的蛋白质经常有几十个氨基酸的不同，其中只有一小部分是与特定功能差异有关的。大量的中性突变只能干扰科学家辨别分子的规律。在实验室的进化实验中，种系很清楚，而且突变主要是适应性的。Amold等人使用高保真DNA改组成功地区分出基因中的功能性和非功能性突变。通过定向进化来研究蛋白质的结构和功能的关系，可为蛋白质的理性设计提供理论依据。
参考文献
1.Zhao Huimin;Arnold Frances H 查看详情[外文期刊] 1997
2.Zhao Huimin;Arnold Frances H 查看详情[外文期刊] 1997(94) 3.Greener A;Callahan. M Perform Random Mutagenesis 1994
4.Seiichi Taguchi;Akiyoshi Ozaki;Haruo Momose 查看详情[外文期刊] 1998(02) 5.Zhao H;Giver L;Shao Z;Affholter JA Arnold FH 查看详情 1998(03) 6.Shao Zhixin;Zhao Huimin;Arnold F.H 查看详情[外文期刊] 1998(02)
7.Moore Jeffrey C;Arnold Frances H Directed evolution of a para-nitrobenzyl esterase for aqueousorganic solvents.[外文期刊] 1996(4)
8.Moore Jeffrey C;Arnold Frances H Directed evolution of a para-nitrobenzyl esterase for aqueousorganic solvents.[外文期刊] 1996(4) 9.Zhao Huimin;Arnold Frances 查看详情[外文期刊] 1997 10.Chen Keqin;Arnold F.H 查看详情[外文期刊] 1993
11.Zhang Ji-hu;Dawes Glenn temmer;Willem P. C Directed evolution of a fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening[外文期刊] 1997(9) 12.Arnold F.H In IBC Directed Enzyme Evolution 1998
13.Arnold Frances H;Moore Jeffrey C 查看详情[外文期刊] 1997 14.Harayama Shigeaki 查看详情 1998
15.Stemmer Willem P C 查看详情[外文期刊] 1994 16.Stemmer W.P.C 查看详情 1994
17.Arnold Frances H Accounts of Chemical Research
18.Ghadessy F;Ong J L;Holliger P Directed evolution of polymerase function by compartmentalized selfreplication[外文期刊] 2001(08)
19.Hertzberg R P;Pope A J High-throughput screening: new technology for the 21st century[外文期刊]2000
20.Soumillion P;Fastrez J Novel concepts for selection of catalytic activity[外文期刊] 2001
21.Amstutz P;Forrer P;Zahnd C In vitro display technologies: novel developments and applications[外文期刊] 2001
22.Sieber V;Martinez C A;Arnold F H Libraries of hybrid proteins from distantly related sequence 2001
23.Lutz S;Ostermeier M;Benkovic S J Rapid generation of incremental truncation libraries for protein engineering using α-phosphothioate nucleotides 2001(04) 24.Moore J C;Jin H M;Kuchner O Strategies for the in vitro evolution of protein function:enzyme evolution by random recombination of improved sequences[外文期刊] 1997(03)
25.Stemmer W P C Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling 1994(04) 26.You L;Arnold F H Directed evolution of subtilisin E in Bacillus subtilis to enhance total activity in aqueous dimethylformamide[外文期刊] 1996(01) 27.Chen K;Arnold F H Enzyme engineering for nonaqueous solvent:random mutagenesis to enhance activity of sublisin E in polar organic media 1991
28.Yano T;Kagamiyama H Directed evolution of ampicillin-resistant activity from a functionally unrelated DNA fragment: A labratory model of molecular evolution 2001(03)
29.Coco W M;Levinson W E;Crist M J DNA shuffling method for generating highly recombined genes and evolved enzymes[外文期刊] 2001
30.Shao Z;Zhao H;Arnold F H Random-priming in vitro recombination: an effective tool for directed evolution[外文期刊] 1998(02) 31.Zhao H;Giver L;Shao Z Molecular evolution by staggered extension process(StEP)
in vitro recombination 1998(16)
32.Crameri A;Raillard S A;Bermudez E DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates evolution[外文期刊] 1998(03)
33.Zhang J-H;Dawes G;Stemmer W P C Directed evolution of a fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening[外文期刊] 1997(09)
34.Ostermeier M;Shim J H;Benkovic S J A combinatorial approach to hybrid enzymes independent of DNA homology[外文期刊] 1999
35.Abecassis V;Pompon D;Truan G High efficiency family shuffling based on multi-step PCR and in vivo DNA recombination in yeast 2000(20)
引证文献
1.张建云.谷立坤.陈红歌 基于易错PCR技术的α-淀粉酶基因的定向进化研究[期刊论文]-中国酿造 2010(2)
2.刘治江.贺淹才.李红然.刘嘉.施腾鑫 采用易错PCR对粘质沙雷氏菌几丁质酶C进行定向进化[期刊论文]-华侨大学学报（自然科学版） 2010(1)
3.单世平.夏立秋.丁学知.刘石泉.张友明 DNA改组的最新动态及应用前景[期刊论文]-中国生物工程杂志 2009(10)
4.李寿崧.郭立新.江树勋.陈文炳.邵碧英 嗜水气单胞菌气溶素基因的克隆与序列分析[期刊论文]-微生物学通报2008(5)
5.曹世诺.于龙政.薛书江.贾立军.周末.张守发 牛瑟氏泰勒虫P23和P33表面蛋白双基因融合表达载体的构建及原核表达[期刊论文]-中国预防兽医学报 2008(11)
6.王劲.徐婧.金丹.杜世章 用体外定向进化的方法对EPSPS合酶基因草苷膦抗性机制的研究[期刊论文]-四川大学学报（自然科学版） 2007(1)
7.李晶琴.李慎涛.温铭杰.吕喆.孙宝清.许子华.孔庆利.安云庆 人杀菌通透性增强蛋白功能性N端片段在酵母细胞表面的展示和鉴定[期刊论文]-中国免疫学杂志 2007(8) 8.王皓.康现江.王琦 重组PCR技术研究进展和应用[期刊论文]-中国生物工程杂志 2007(5)
9.孔荣.钮利喜.袁静明 酶分子在试管内的定向进化及其在手性有机物合成中的应用[期刊论文]-化学进展 2006(2)
10.孙博.王捷 蛋白质分子体外定向进化研究进展[期刊论文]-实用医学杂志 2006(11) 11.李晶琴.李慎涛.安云庆 基于PCR技术的蛋白质改造策略[期刊论文]-国际检验医学杂志 2006(12)
12.牛卫宁 少根根霉脂肪酶基因的表达和定向进化研究[学位论文]博士 2006 13.杨鹏.陈喜文.陈洁.陈德富 单分子PCR技术及其应用[期刊论文]-生命的化学 2005(3)
14.柳志强.孙志浩.郑璞.冷泳.钱嘉南 D-泛解酸内酯水解酶的定向进化[期刊论文]-生物工程学报 2005(5)
15.钟茂.谢和芳 饲料木聚糖酶的开发[期刊论文]-饲料工业 2005(14) 16.钟茂.谢和芳 饲料木聚糖酶的开发[期刊论文]-饲料工业 2005(14)
17.邵宏波.梁宗锁.邵明安 转基因生物体对生态环境的影响及其发展趋向[期刊论文]-农业工程学报 2005(z1)
18.张颖 tox-1基因的酵母高效表达和功能研究[学位论文]硕士 2005
19.耿旭 枯草杆菌安舒克栓酶随机突变、筛选及其部分性质研究[学位论文]硕士 2005 20.沈国妙.姚泉洪.张铭.彭日荷.熊爱生 利用DNA改组技术改造aac C1基因启动子活性的研究[期刊论文]-微生物学报 2004(1)
21.陈涛 基于基因组重排的产核黄素枯草芽孢杆菌的代谢工程[学位论文]博士 2004 22.周潜 枯草芽胞杆菌肌苷发酵过程参数相关分析及PurR蛋白突变文库的构建[学位论
文]硕士 2004
23.徐卉芳.张先恩.张治平.张用梅.A.E.G.CASS 大肠杆菌碱性磷酸酶的体外定向进化研究[期刊论文]-生物化学与生物物理进展 2003(1)
24.张少平.崔堂兵.陈亮.郭勇 豆豉纤溶酶的定向进化[期刊论文]-华南理工大学学报（自然科学版） 2010(9)
25.黄春晓.段学军 蛋白质定向进化的高通量筛选方法[期刊论文]-山东农业大学学报(自然科学版) 2008(4)
26.王青艳.陈发忠.黄福宝.韦传东.韦宇拓.黄日波 Thermobifida fusca海藻糖合成酶的定点突变及其动力学性质研究[期刊论文]-广西农业生物科学 2007(2)
27.耿旭 枯草杆菌安舒克栓酶随机突变、筛选及其部分性质研究[学位论文]硕士 2005 28.杨登峰 新型甘油脱水酶同源基因的克隆、表达及其理性设计[学位论文]硕士 2005