在低浓度一段装入搅拌子。且要形成梯度。 3．柱的平衡
将柱子与恒流泵连通，用25ml Tris-HCl pH7.3缓冲液进行冲洗平衡完成后，交换剂上方需保留5ml左右的缓冲液。
4．加样
缓慢加样，不能把柱面冲到导致柱面不平，这是实验成功的关键之一 5．洗脱
为防止液面低于交换剂表面，加入了5ml缓冲液。 6．测OD值
在紫外分光计光度计上测出每管在280nm处的紫外吸光度OD值。 得到各管的OD值如下： 表2-2 试管号 OD值 试管号 OD值
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
0.630 0.237 0.145 0.165 0.121 0.114 0.066 0.049 0.082 0.169 0.350 0.431
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
0.528 0.551 0.198 0.094 0.174 0.174 0.099 0.041 0.051 0.006 0.012
7．酶活力测试
用葡萄糖测验试纸测试每管内蔗糖酶的活力大小，由以上OD值，取13 、14、19管进行测试。
酶活力测试方法：在点滴板中滴2滴5%蔗糖，再加2滴待测洗脱液，用玻璃棒搅匀，放置5min，浸入葡萄糖试纸，1s后取出，60s比较颜色深浅。
将其合并成一管，VD=5.6ml
2.2.4结果与分析
2.2.4.1结果 VD =5.6ml
VD总=VD·VC总/V样=5.6×6.1/0.5=68.32ml。 由数据得表如下：
0.70.60.5OD值0.40.30.20.101357911131517192123系列1系列2试管号
图2-1 Q Sepharose-柱层析法提纯酶数据处理表
2.2.4.2分析
先用25mlTris-HCl洗穿透锋，得到8只试管。但是如果在用量筒接的时候每管不是3ml，那么也许就没有8只了，这是实验的大忌。会造成很大的误差，用梯度洗脱时，测得的OD值会成波动形式，而不是直线上升或者直线下降。
如果上提取液c中的酶浓度不够高，也可能导致提纯酶浓度不够高，以后在检验活力的时候会发现D根本就没有酶活力，于是实验重做，我们在做这个实验的时候应该想到各种情况带来的实验误差。
在收集D时，我们不小心到出了些，考虑到 可能不够用，所以多取了一试管的D液。
在使用Q-Sepharose纯化方法之前还有过DEAE-纤维素层析方法和DEAE Sepharose层析方法，但比较这几种方法，用Q-Sepharose纯化方法有如下特点： (1) 提高实验效果。琼脂糖凝胶离子交换介质比纤维素介质载量高,分离纯化蔗糖酶穿透峰小,分辨率高,回收率高。蔗糖酶与杂蛋白得到了很好的分离,提高纯度,真正体现离子交换色谱蛋白质纯化上的优越性,增强实验的意义。
(2) 缩短实验时间。梯度洗脱时间由原来的100min缩短到现在的50min,减少不必要的实验重复,实验过程比较紧凑。 (3) 节约实验支出。离子交换介质DEAE-纤维素由于流速慢,柱床高度会随缓冲液浓度及pH改变,不能承受0.1M以上NaOH清洗,重生效果差,寿命短。琼脂糖介质在分辨率、回收率、流速等具有优越性。且其化学稳定性极高,不易破碎,可以承受1MNaOH的清洗,重生效果好,可以使用数百至上千次,因而降低了成本。
2.2.4.3结论
VD 5.6ml
VD总 =68.32ml。
2.2.5注意
①在整个柱操作过程中，要严格防止液面低于交换剂的表面。当液面低
于交换剂表面时，空气进入交换剂内，形成气泡，而影响分离效果。
②加样不可太快，以免搅浑交换剂的表面，而使分离不纯。
③恒流泵的流速要控制好，要速度有利于液体滴下来，同时防止液体下滴过快而引起干柱。是绝对不能干柱。
2.3 蔗糖酶活力的测定 2.3.1实验原理
本实验用DNS法测还原糖的含量，进而计算酶的活力。
蔗糖水解产生的葡萄糖和果糖均是还原性糖，可以在氢氧化钠和丙三醇的作用下与2,3,5-二硝基水杨酸反应，生成的棕红色氨基化合物在540nm波长处有最大吸收。在一定范围内还原糖的量与其吸光值呈线性关系，于是做出葡萄糖标准曲线以后，就可以利用比色法可测出样品中的还原糖含量。
酶活力是指某种酶在最适PH、温度等条件下催化底物水解的能力，通常以一段时间后底物的减少量或产物的生成量多少来表示。 酶活力单位数（U）：在一定条件下，3min内能水解蔗糖成还原糖1mg所需的酶量，称为1个活力单位数。
总活力单位数=（V测体积测出的葡萄糖克数/V测）*(试管溶液总体积/2)*V总*n V总为各种提取液在提取过程中的总体积。
酶回收率=（各提取液的总酶活/处提取液A的总酶活）*100%
2.3.2试剂与器材
2.3.2.1试剂
①3,5-二硝基水杨酸
（1）甲液：溶解6.9g结晶酚于15.0ml10%氢氧化钠溶液中并用水稀释至69ml，在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。
（2）乙液：称取255g酒石酸钾钠加到330ml10%氢氧化钠溶液中，再
加入880ml1%3,5-二硝基水杨酸溶液。
将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，贮于棕色瓶中备用，在室温放置7~10天后使用。
②葡萄糖标准溶液（0.2mg/ml） 准确称取20mg分析纯葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量移入100ml的容量瓶中，定容。5%蔗糖、；
③0.2mol/L pH4.6醋酸缓冲液 溶解10.83g醋酸钠于水中，加近260ml的1 mol/L醋酸调pH到4.6，稀释至2L；
① 5%蔗糖 用0.2mol/L pH4.6醋酸缓冲液配置； ② 2mol/L NaOH 溶解0.80g氢氧化钠于10ml水中。 2.3.2.2器材 ①电炉；
②恒温水浴;
③紫外分光光度计； ④试管、吸管；
2.3.3操作方法
1．葡萄糖标准曲线的制作
取6支试管，分别按表3-1加入各种试剂。将各管内液体混合均匀，在沸水
浴加热5min。取出后立即用冷水冷却到室温，于540nm波长处测OD值，以葡萄糖的毫克数为横坐标，OD值为纵坐标，画出标准曲线。
表2-3 葡萄糖标准曲线的制作
试管号 0 1 2 3 4 5 葡萄糖 0.0 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 蒸馏水 3.0 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 DNS 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 总体积 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 OD 0.000 0.121 0.236 0.359 0.482 0.599 2．酶活力测定
①将前个实验所得四部分提取液用冷蒸馏水按比例稀释：初提取液A（1：200）；热提取液B(1:200)；乙醇提取液C（1：200）；柱分离液D（1：20）。
②取8支试管，按表3-2加入各种试剂。
表2-4 酶的催化反应 项目 A（1：200） B(1:200) C（1：200） D（1：20） 加样 A对 A样 B对 B样 C对 C样 D对 D样 酶液/ml 2 2 2 2 2 2 2 2 2N NaOH 0.5 — 0.5 — 0.5 — 0.5 — 35℃预热10min，同时预热5%蔗糖 5%蔗糖 2 2 2 2 2 2 2 2 立即摇匀，准确计时，反应3min 2N NaOH — 0.5 — 0.5 — 0.5 — 0.5 总体积/ml 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 ③取反应液A 0.25ml，B 0.25ml，C 0.20ml，D 0.3ml进行DNS反应，测定540nm处OD值。
得到ODA=0.193 ODB=0.161 ODC=0.306 ODD=0.284
2.3.4结果与分析
2.3.4.1结果
①绘制葡萄糖标准曲线
图2-2
总活力单位数=mg/V测·4.5/2·V总·n
酶的回收率=（各提取液的总酶活/初提取液A的总酶活）·100%
本次试验最终结果：表2-5
项目 V测/ml mg V总/ml 初提液A 热提取液B 乙醇提取液C 柱分离液D 0.25 0.185 25.62 0.25 0.174 24 0.2 0.222 6.1 0.3 0.215 68.32 总活力单位数/U 回收率/% 8531.46 100 7516.8 88.1 3046.95 35.7 2203.32 25.8 2.3.4.2分析 本次实验基本还算成功，葡萄糖标准曲线的线性较好，乙醇提取液C的回收率较低，可能实验操作带来的误差。本次试验的计算公式有严格的要求，经过反复演
算方才能得出实验结果。 实验公式可以改为：总活力单位数=mg/V测*4.5/V配*V总/V取 其中，V取 表示稀释时的取样数 V配 表示稀释后的毫升数
这是第一次用办公软件处理数据，感到很新鲜，也意识到计算机在科学研究中的重要性。
2.3.5注意
①做葡萄糖标准曲线时，加完各种试剂后要充分摇匀。要求测得的OD
值在0.1~0.7
②测定酶活力时，要准确反应3min，这个反应时间应该精确把握，不要