甘草组织培养快速繁殖技术研究
于林清 何茂泰 王照兰
(中国农业科学院草原研究所 ,呼和浩特 010010)
许占友 斯日古楞
(中国农业科学院品资所 ,北京 100081) (内蒙古锡盟草原站 , 026000)
摘要 :比较了三种甘草组织培养快速繁殖途径 ,研制了不含激素的快速生根培养基 ,提出了用 塑料盒培养甘草带 2叶茎段直接生根成苗快速繁殖技术及育苗措施 ,使甘草组织培养快速繁殖技 术实用化、厂化。
关键词 :甘草 ;组织培养 ;快速繁殖 分类号 : S541 文献标识码 : A
工
文章编号 : 1000 - 6311 (1999) 01 - 0012 - 14 Study on Techniques for Rapid Propagation of Licorice ( Glycyr r hiza ur alensis Fisch) stit ute of C. A . A . S . Hohhot 010010) , XU Zhanyou ( Instit ute of Crop Germplasm Resources of C. A. A. S. Beijing 100081) , SI Riguleng ( Grassland S tation of Xi L in niques for rapid propagation and growing seedling of licorice by cult ure of stem section wit h 2 leaves were discussed. Key words : Licorice ; Tissue cult ure ; Rapid propagation
甘草 ( Glycyrrhiza uralensis Fisch)是豆栽培甘草。然而 ,由于野生甘草种子发芽率
科多年生牧草 ,茎叶为牲畜冬春良好饲料 ,根低 (仅为 5 %～ 10 %) ,所以开展组织培养快 为重要的药材[ 1 ] ,中医用途广泛 ,有十方九速繁殖甘草种苗就具有重要的理论意义和市 草之称。近年来 ,人们将甘草广泛应用于化场前景。 妆品、食品、烟草、制药等行业[ 2 ] ,使甘草身 价倍增。但由于人们大量采挖甘草 ,使甘草 资源日趋枯竭 ,内蒙古科委已将其列入第四
收稿日期 :1998 - 05 - 06
作者简介 :于林清 ,男 ,助研 ,硕士 ,1965年生 ,1991年 内蒙古农牧学院植物生理生化专业研究生毕业 ,现主要从
Guo L eague 026000) : Grassland of China , No. 1 , 1999 , pp . 12～14 ,18.
供甘草药材商品 ,迫切需要开展大面积人工事牧草生物技术及育种研究工作 ,已发表论文 9篇.
批保护植物[ 3 ] ,其它省区情况也大致相同。 为保护甘草这一宝贵的种质资源并向社会提
关于甘草组织培养方面的研究工作比较 少 ,仅见苟克俭[ 4 ]、安利佳等人[ 5 ]有研究报 道 ,但距实际应用大量快速繁殖甘草种苗尚 有较大差距。为此 ,我们在“七五”以来牧草 组织培养研究工作的基础上 ,从甘草的外植 体诱导愈伤组织分化成苗、培养腋芽丛状茎 生根成苗和带叶茎段直接生根成苗三个方面 探讨了甘草种苗快速繁殖的途径 ,以期建立 甘草种苗快速繁殖程序 ,为工厂化育苗提供 技术支持。
13
困难 ,仅下胚轴愈伤组织分化成再生植株 ,分 化率也不稳定 ,约在 3 %～6 %之间。能够分 化的愈伤组织特征是 :愈伤组织致密、颗粒 状 ,其上出现绿色芽点 ,分化成无根苗 ,将它 们转移到生根培养中生根成苗 ,炼苗后移至 田间。
表 1 甘草不同外植体愈伤组织诱导、
分化、根成苗 ( %) 生
培养基
子 叶
80 0 0 外 植 体 下胚轴
95 3～6 80
胚 根
72 0 0
愈伤组织诱导 愈伤组织分化
生根成苗
1 材料和方法
供试野生甘草种子来自内蒙古伊克昭盟 医药公司 ,田间甘草植株来自本所牧草试验 地。由于甘草茎腺毛、体较多 ,消毒灭菌困 腺 难 ,污染程度高 ,可操作性差 ,故实验材料均 采用种子消毒 ( 0. 1 %升汞)破皮后在三角瓶 MS培养基制备无菌苗 ,然后筛选三种成苗 途径中所需合适的培养基、培养条件。条件 摸清后 ,按此条件进行三种途径甘草繁殖系 数的比较 ,建立优化的快速繁殖技术。
2. 2 培养腋芽丛状茎生根成苗
经筛选 24个配方 ,确定的最佳培养基为 MS + 6 - BA 0. 8mg/ L + NAA 1. 2mg/ L + 3 %蔗糖 + 0. 8 %琼脂。6 - BA的浓度与甘 草腋芽的形成有一定的关系 ,6 - BA的浓度 过高过低均降低腋芽形成丛状茎的数量。上 述最佳培养基诱导腋芽形成丛状茎的数量最 多 ,一个无根茎段经 30d左右可形成 5～9个 丛状茎 ,15～20d生根成苗 ,6个月左右可繁 殖 100～ 120株幼苗 ,其移栽成活率为 50 % 左右 ,可移栽成活植株 50～60棵。 2. 3 带叶茎段直接生根成苗
已报道的生根培养基大都含有萘乙酸等 激素 (或植物生长调节剂) ,以诱导植物生根。 但是 ,用这些培养基诱导茎段生根往往对植 物后续生长有影响 ,我们进一步配制了简化 生根培养基 MSNAO ,其主要成分是 MS + 13. 5mg/ L KH2 PO4 + 3 %蔗糖 + 0. 8 %琼脂。 这个培养基不含有任何激素 (植物生长调节 剂) ,增加了 P和 K的含量 ,使甘草茎段生根 速度快而健壮 ,而且生根率、苗移栽成活率 种 均较其它配方高 (表 2)。
为了进一步明确甘草茎段在 MSNAO中 继代培养的效果 ,我们对四种培养基的利用 时间、用次数、殖系数进行了比较。结果 利繁
2 试验结果
2. 1 甘草外植体诱导愈伤组织分化成苗
经 165个配方试验 ,筛选出的培养基为 : 愈伤组织诱导培养基是 MS + 2 , 4 - D 1. 2 mg/ L + 6 - BA 1. 0mg/ L + 3 %蔗糖 + 0. 8 % 琼脂 ;分化培养基是 MS + 6 - BA 0. 8mg/ L + KT 0. 1mg/ L + NAA 1. 5mg/ L + 3 %蔗糖 + 0. 8 %琼脂 ;生根培养基是 MS + NAA 0. 1 mg/ L + 0. 8 %琼脂。外植体试验了子叶、下 胚轴、根1℃;光周 胚 ,培养条件为 :温度 25±
期 12h光/ 12h暗 ;光照强度为 1500L x。培 养结果如表 1所示。
从表 1可知 ,甘草外植体愈伤组织诱导 率以下胚轴最高 ,达到 95 % ,子叶和胚根的 诱导率分别为 80 %、72 % ,这说明甘草愈伤 组织易于诱导。但是 ,其愈伤组织分化十分
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一倍多。由于这种培养基配制简单 ,不需添 加激素或植物生长调节剂 ,效果又相当好 ,所 科
以便于在生产、研中推广。
对甘草带不同叶茎段材料进行生根成苗 的试验结果 (表 4)表明 ,带 2叶茎段的繁殖 系数最高 ,达到 98 ;带 1叶茎段移栽成活率 低 ,繁殖 1代周期长 ,繁殖代数少 ,繁殖系数
表 3 甘草茎段在不同生根培养基中
直接生根成苗效果比较 培养基 14 中 国 草 地
1999年 移 表 2 甘草茎段在 MSNAO及其它三种生根
培养基中的生根率、栽成活率 生根培养基
MSNAO
MS + NAA 0. 1mg/ L MS + NAA 0. 2mg/ L MS + NAA 1. 0mg/ L
生根率移栽成活率
( %) ( %) 92～95 68～70 72～74 75～78
85～90 60～65 61～63 58～65
仅为 57 ;带 3叶茎段尽管生根率、移栽成活 率均较高 ,但一株材料切成的段数较少 ,繁殖 系数仍较低。由此可见 ,甘草带 2叶茎段成 苗繁殖效果最好。 我们将三角瓶改成塑料盒 ( 10×9× 6cm) ,采用茎段生根直接成苗 ,一盒能扩繁 50～60株甘草种苗。由 300个塑料盒扩繁 的甘草种苗达 1. 2～ 1. 4万株 ,可满足 1/ 15hm2地生产用苗。由于塑料盒重量轻、 保存运输方便 ,所以用塑料盒培养带 2叶茎
简
段直接生根成苗 ,对于扩繁甘草具有快速、
实
便、用性强的特点 ,推广价值很大。
利用时间利用 (d)次数 160～180 6 150～160 5 150～160
5
繁殖系数 (3个月)
42 18 17
MSNAO
MS + NAA 0. 1mg/ L MS + NAA 0. 2mg/ L
MS + NAA 1. 0mg/ L 100～120 4 16
注 :利用时间指一个甘草带叶茎段能够反复切段繁殖 天数 ;利用次数指一个甘草带叶茎段切段繁殖次数 ;繁殖系 数指一个甘草带叶茎段经 3/ 6月后繁殖移栽成活植株数。
(表 3)表明利 , MSNAO不仅使甘草茎段利用时 间延长、用次数增多 ,而且使繁殖系数增加
表 4 甘草带不同数叶茎段在 MSNAO中直接生根成苗情况 (1株材料培养 6个月)
带叶茎段 带 1叶 带 2叶 带 3叶以上
生根成苗株数 95 115 60
生根率
( %) 87 92 95
繁殖系数 (6个月)
57 98 53
移栽成活率
( %) 60 85 88
繁殖 1代所需天数 43～46 29～31 28～30
繁殖系数 4 6 6
甘草再生植株幼苗移栽也是本项工作中 极为重要的一部分。我们采取的措施是 :弱 光下开瓶 ,加 10 %MS (不加琼脂)炼苗 3d ,然 后移入育苗杯 ,弱光条件下生长 4～5d ,转入 正常光线生长到 10～15cm移入田间。
化成苗 ,其分化率仅为 3 %～ 6 % ,而其它外 植体没有分化 ,因此利用这一途径繁殖甘草 种苗困难较大 ,也谈不上快速繁殖。通过诱 导甘草腋芽丛状茎生根成苗 ,经 6个月培养 可扩繁 4代 ,计 100～120株幼苗 ,但其移栽 成活率仅为 50 % ,1株材料经 6个月培养可 繁殖并移栽成活 50～ 60株 (繁殖系数 50～ 60) ;而带 2叶茎段直接在生根培养基上繁 殖 ,6个月可扩繁 6代 ,繁殖系数 (每株材料 实际繁殖移栽成活株数)高达 98 ,这种用塑 料盒培养带 2叶茎段直接生根成苗的方法 ,
(下转第 18页)
3 讨论
比较三种甘草组织培养繁殖种苗方法不 难看出 ,通过甘草外植体诱导愈伤组织→分 化→生根成苗这一途径不仅操作繁琐 ,人力、 物力消耗大 ,而且效果并不好 ,主要是甘草愈 伤组织分化困难。由甘草下胚轴愈伤组织分
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料 ,在改良的 MB - 9培养基中可较快建立起 胚性细胞悬浮系。悬浮培养初期 ,悬浮细胞 系颜色较淡 ,经镜检发现此时存在一定比例 的衰老死亡细胞和非胚性细胞 ,经过强化培 养 (每 3～4d换液一次) ,在较短时间内胚性 的生长旺盛 ,小细胞团明显增多 ,逐渐取代了 非胚性细胞 ,两个月后红三叶和白三叶的叶 片愈伤组织均可获得胚性细胞悬浮系 ,但来 自叶柄的愈伤组织未获得胚性细胞悬浮系。 可见 ,在不同外植体之间存在着显著差异。
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