生物材料细胞生物学评价实验手册
一、 细胞培养技术
（一）试剂配制
1. L-DMEM, H-DMEM基础培养液
700ml超纯水溶解一包L-DMEM培养基（内含10g粉末）或H-DMEM培养基（内含13.4g粉末），并称取2.2g碳酸氢钠融入其中，搅拌后定容至1000ml。（调PH 7.2-7.4）
2. L-DMEM, H-DMEM完全培养液
L-DMEM基础培养液加入10％的胎牛血清，0.22μm过滤器除菌，4℃保存。
3. 25×PBS （储液）
称取：氯化钠50g，氯化钾1.25g，磷酸氢二钠18.1g，磷酸二氢钠1.56g，加入约200ml水中，充分溶解后定容至250ml（调PH 7.2-7.4），室温保存。
4. 1×PBS（工作液）
取40ml25×PBS稀释25倍，即加超纯水定容至1000ml，高温灭菌。（调PH 7.2-7.4）
5. 0.25％/0.02%胰酶/EDTA
称取2.5g胰酶，0.4gEDTA溶解于约900ml1×PBS中，搅拌充分溶解后，4℃过夜。第二天，调PH值至7.2，定容至1000ml，0.22μm过滤器除菌，4℃保存。
6. 细胞冻存液
L-DMEM/H-DMEM基础培养液、胎牛血清和DMSO按照1：3：6的比例混和，0.22μm过滤器除菌。
7. 成脂诱导液 （1）脂肪诱导液(AI)
在H-DMEM完全培养液加入终浓度为1μmol/L地塞米松、
0.5mmol/LIBMX、100mmol/L吲哚美辛和10μg/ml 牛胰岛素，0.22μm过滤器除菌，4℃保存。 （2）脂肪保持液(AM)
在H-DMEM完全培养液加入终浓度为10μg/ml牛胰岛素，0.22μm过滤器除菌，4℃保存。
8. 成骨细胞诱导液（OS）
在L-DMEM完全培养液加入终浓度为0.1μmol/L地塞米松、10mmol/L甘油磷酸钠和50mg/ml VitC，0.22μm过滤器除菌，4℃保存。
9.成软骨诱导培养液
高糖DMEM＋10 ng/mL TGF-β3+50 ng/mL IGF-1+20% FBS 10. 油红O染液的配制
用蒸馏水稀释异丙醇稀释至60％，加入油红O直至不再溶解，37℃水浴，加入更多的油红O，直至饱和，室温保存。
11. 茜素红染液的配制
茜素红2g溶解于100ml蒸馏水中，用10％氢氧化氨调PH值至4.2，室温保存。
附：成骨分化培养基储液的配制：
1.Ascorbid Acid (Vitamin C) sigma公司产品（目录号是A4544） 储液浓度是20mM，使用终浓度是0.2mM。 配制方法是：
秤取35.22mg溶解于10ml超纯水中，分装成1ml，－20℃保存。 2.β－glycerophosphate disodium salt，pentahydrate Calbiochem公司产品，目录号是35675 储液浓度是1M，使用浓度是10mM。 配制 方法是：
秤取15.3g， 溶解于40ml超纯水中，溶解之后，定容至50ml，分装成1ml，－20℃保存。
3. 地塞米松(dexamethasone) sigma 公司产品，目录号是D4902或D1756。
储液浓度是1mM，使用浓度是0.1μM。 配制方法是：
秤取4mg，溶解于10ml无水乙醇中，分装成1ml，－20℃保存。
成脂分化培养基储液的配制：
1. indomethacin（吲哚镁辛），sigma公司产品，目录号是I7378 储液浓度是100mM，使用浓度是0.2mM 配制方法是：
秤取358mg，用10mlDMSO（sigma公司产品，目录号是D2650）溶解，分装成0.4ml，－20℃保存。
2. insulin，sigma公司产品。目录号是I6634 储液浓度是5mg/ml，使用浓度是10μg/ml。 配制方法是：
秤取50mg，用10ml的0.01N的HCL溶解（将浓盐酸稀释1200倍），用一次性过滤器过滤除菌之后，分装成0.5ml，－20℃保存。
注意：insulin使用时要注意保持insulin储液的无菌，经过除菌的insulin可在4℃冰箱放置半年以上。
3. IBMX，sigma公司产品，目录号是I5879 储液浓度是250mM，使用中浓度是0.5mM 配制方法是：
秤取222mg，溶解于4mlDMSO，分装成0.4ml，－20℃保存
4. 地塞米松(dexamethasone) sigma 公司产品，目录号是D4902或D1756。 储液浓度是1mM，使用浓度是1μM。 配制方法是：
秤取4mg，溶解于10ml无水乙醇中，分装成1ml，－20℃保存。
（二）细胞原代培养
1.人骨髓间质干细胞原代（hMSCs）
骨髓取自非造血系统、非遗传性疾病且未累及骨髓的正常成人骨
髓,一般20ml.
（1）骨髓用1XPBS按1:1稀释
（2）用吸管将骨髓缓缓加入含Ficoll-Hypaque（淋巴细胞分离液，1.077g/ml）的无菌离心管中，两者体积之比是4：6。
（3）离心，2000rpm×20min，缓缓减速（离心机降速设置为0）。（4）离心结束后，在淋巴分离液与上层血清之间可见一白色薄细胞层，即为有核细胞层。小心吸出细胞加入1×PBS中洗涤细胞一次后
（5）用1mlL-DMEM完全培养液重悬细胞，接种于细胞培养瓶中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养，标记为P0。（20ml骨髓可接种3-4个25CM培养瓶）
（6）3d后全量去除非贴壁细胞，此时可见单个或数个长梭形细胞形成的克隆。以后每3~4d全量换液一次。
（8）10～20d，原代细胞达到80～90%融合后传代培养 2. 大鼠骨髓间质干细胞（RMSCs）的原代培养 （1）四周龄SD鼠脱颈处死，75%酒精浸泡5min （2）无菌条件下分离剪取两侧大鼠股骨及胫骨近端
（3）用1ml注射器吸取L-DMEM培养基反复冲洗分离的股骨及胫骨
（4）骨髓冲洗液离心后接种到细胞培养皿中 （5）3d后换液，倒置显微镜观察克隆的形成
（6）7～10d，原代细胞达到80～90%融合后传代培养 3. 兔软骨细胞的原代培养
2-4周龄新西兰大白兔苯巴比妥钠麻醉后耳缘静脉注射空气迅速处死, 剥 皮后用大剪刀分离膝关节处肌肉等软组织，暴露膝关节。无菌条件下用手术刀片仔细从兔膝关节表面削下软骨组织片，收集在PBS中，充分剪成ｌmm3以下的组织块，用PBS清洗3遍。加入软骨体积10~15 倍的0.25%胰蛋白酶37℃消化0.5-1小时，再用PBS冲洗两遍，加入0.2%II型胶原酶的D-Hanks消化液，37℃消化4-6小时以
上，每2小时收集细胞悬液一次，直至软骨组织块基本消失、溶液变混浊为止，加入含10%小牛血清的DMEM培养液, 稀释II 型胶原酶, 终止消化并将细胞团吹打成单个细胞后用200 目滤网过滤, 收集滤液, 3 000r/min 离心5min。弃上清,收集滤液。计数细胞，以1×105～1×106个/ml的密度接种，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中传代培养，每2天换１次培养液，倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况，细胞铺满单层后进行传代培养。
（三）细胞传代培养
原代培养至细胞约80－90%融合，用胰酶进行传代。先将旧培养液弃去，1×PBS洗两次后加入0.25%胰酶，于镜下观察。见细胞变圆即将脱壁时，拍打瓶底数次，加入3倍以上体积的完全培养液终止胰酶作用，并用吸管反复吹打使细胞脱壁。转移细胞至离心管中，并用1×PBS将瓶底洗一次，尽可能搜集更多的细胞，离心，重悬，按1：2比例接种并标记为第一代（P1），继续培养。以后约每3~4d传代一次。
（四）细胞冻存和复苏
将约80~90%融合的细胞消化、离心弃去上清夜，加入1ml细胞冻存液重悬后，转移细胞至无菌细胞冻存管中，密封。细胞放入冻存盒（或按4℃30min，－20℃2h将细胞转移）至－80℃冰箱，最终保存于液氮中。
冻存的细胞取出后立即放入37℃水浴2-3分钟内融化，快速转移至含4ml完全培养液的离心管中，混匀后离心，1100rpm/min, 4min.离心后细胞用完全培养液重悬，接种。
二、细胞与支架复合培养
支架在培养液预湿过夜，接种前在无菌超净台吹至半干，用无菌镊子夹取至孔板，每孔一个支架。将已消化好的一定体积高浓度细胞悬液接种到每个支架表面，在37℃，5％CO2的恒温培养箱中静置培养3h，然后每孔加入相应培养液。