Western blot（蛋白印迹法）详细步骤
一、 组织的研磨
准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套 步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。
②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。
③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。 ④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。
注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h以上。
2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。 3.每种样品都最好留有副管，备用。
二、 裂解提蛋白
准备：裂解液配制比例 RIPA:PMSF=1000：10=100：1
若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）
步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。
②盖好盖子，在冰上裂解30~40min. ③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。
注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。
三、 BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）
准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床
步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。 ②按下表在酶标仪中加入试剂，绘制标准曲线。 孔号 0 1 1 9 1 2 2 8 2 3 4 6 4 4 6 4 6 5 8 2 8 6 10 0 10 蛋白标准液（μl） 0 去离子水（μl） 10 蛋白含量（μg） 0
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μl BCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
注意：1.标准曲线一般做两组，取最好的标准曲线计算。 2.蛋白浓度=（蛋白含量/总体积）×稀释倍数[μg/μl]
3.保证样品液中的蛋白含量相同（500μg/100μl）,则取10μl样品液中含有50μg蛋白。
4.样品液稀释液要再沸水浴中煮10min（可用微波炉加热），放凉至室温后于-20℃保存。
四、 SDS-PAGE蛋白质电泳 (一)、配胶
准备：凝胶液各成分、电泳板、制胶架、梳子 步骤:①选择适合电泳板（0.75mm:1.0mm:1.5mm），用自来水冲洗干净后再用蒸馏水冲洗，将玻璃板夹入玻璃板夹，注意底部对齐，夹好后卡到制胶架上。
②首先配制分离胶（一般用12%的SDS-PAGE分离胶），按分离胶配方配制，配胶时最后加APS和TEMED，迅速混匀，注意减少气泡的产生。
③将配好的分离胶迅速加入玻璃板之间至梳子下约1cm处（绿色线处），不要有气泡。灌好胶后用蒸馏水覆盖胶层，加满蒸馏水至玻璃板顶端，以利于丙烯酰胺的聚合。室温静置约30min至胶层与水层检出现明显界限。若室温过低可将其置于37℃烘箱中。
④配制浓缩胶（5%的Arcymalide浓缩胶），混匀，注意减少气泡产生。 ⑤带分离胶聚合后，倒掉上层水，将混匀的浓缩胶沿玻璃板壁小心加在分离胶上至较短玻璃板顶端，插好梳子，不能有气泡，室温静置20~30min至凝胶聚合。
注意：1.夹好玻璃玻璃板后用水检查其是否漏水。 2.12%分离胶配方：
不同体积（ml）凝胶液各成分所需体积（ml） 溶液成分 H2O 30%Arcylamide 5 1.6 2.0 10 3.3 4.0 2.5 0.1 0.1 0.004 15 4.9 6.0 3.8 0.15 0.15 0.006 20 6.6 8.0 5.0 0.20 0.20 0.008 25 8.2 10.0 6.3 0.25 0.25 0.010 30 9.9 12.0 7.5 0.30 0.30 0.012 1.0M 1.3 Tris-HCL(PH8.8) 10%SDS 10%APS TEMED
0.05 0.05 0.002
3.SDS-PAGE浓缩胶配方（5%Arcylamide）
不同体积（ml）凝胶液各成分所需体积（ml） 溶液成分 H2O 30%Arcylamide 2 0.68 0.17 3 1.4 0.33 0.25 0.02 0.02 0.002 4 2.7 0.67 0.5 0.04 0.04 0.004 5 3.4 0.83 0.63 0.05 0.05 0.005 6 4.1 1.0 0.75 0.06 0.06 0.006 8 5.5 1.3 1.0 0.08 0.08 0.008 1.0M 0.13 Tris-HCL(PH8.8) 10%SDS 10%APS TEMED 0.01 0.01 0.001 4.配胶时加入的APS和TEMED是助凝剂，应最后加入，加入后应迅速将配好的胶灌入玻璃板之间，防止其凝固。
(二)、电泳
准备：电泳仪、电泳缓冲液、样品、marker
步骤：①取1×电泳缓冲液，待浓缩胶聚合完全后，将胶架放入电泳槽内，将电泳缓冲液倒满内槽，内槽电泳液灌满后电泳液自动溢出灌满外槽，内槽电泳液低于外槽，拔出梳子，向梳子孔内加样。
②加样量为每孔8μl或10μl，如有剩余的孔，可加入等体积的1×loading buffer上样缓冲液，以防止样品胶跑歪。
③marker一般点在最左侧。 ④将电泳槽与电泳仪连接，打开电泳仪开关，恒压80V预电泳10min至溴酚蓝前沿到达分离胶，将电压调整到恒压120V，电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部，注意不要让溴酚蓝跑出分离胶。
注意：1.电泳的条带依据蛋白的分子量而区分，分子量大的蛋白跑的慢，在上端。 2.电泳液可回收多利用几次，一周左右。
（三）、转膜
准备：甲醇、转膜缓冲液、滤纸、玻璃棒、海绵、PVDF膜或NC膜
步骤：①电泳结束后立即转膜防止蛋白分散，剪取一张与凝胶大小相仿的PVDF膜，2块海绵，6张滤纸。
②将PVDF膜用甲醇活化约3min，然后将膜、凝胶、海绵和滤纸放在盛有转膜缓冲液的托盘中平衡15min。
③取下凝胶用切片切取需要的部分，两端以marker和上样边缘为界，用转膜缓冲液冲洗凝胶几次，在湿转板黑色面放置一张海绵、三张滤纸，再放置凝胶，每一层都要用玻璃棒赶出气泡。
④从甲醇中取出活化的膜在转膜缓冲液中浸洗一下，放在胶上，正面朝凝胶，再放三张滤纸、一张海绵，每一层用玻璃棒赶出气泡，最后夹紧转移夹。
⑤转移夹正极板（白色）对着电泳槽红色面，放入电泳槽中通电转膜，恒压72V或恒流300mA。
注意：1.20KD以上的蛋白转膜时间约1h以上，100KD的蛋白转膜时间约1.5h左右，10KD左右的蛋白转膜时间为20~30min左右。
2.转膜要在冰水浴中进行，避免体系温度过高。
3.操作时要戴手套，用镊子夹持PVDF膜边缘防止划伤膜或染上杂蛋白。
4.PVDF膜可多次曝光（8次左右），NC膜可曝光2~3次。
（四）、封闭
准备：脱脂奶粉、TBST缓冲液
步骤：①转膜结束后，小心取出凝胶和膜，可在膜上观察到预染marker的条带。 ②配制5%的脱脂奶粉（5g脱脂奶粉+100mlTBST缓冲液）封闭液，将膜放入盛有封闭液的容器中，室温摇床封闭1h。
注意：1.可用考马斯亮蓝将凝胶染色以判断转移情况。
2.NC膜可置于丽春红染色液中，室温下染色5min，用双蒸水洗膜至水变清，无色蛋白条带清晰，说明染色效果好。
（五）、一抗孵育
准备：抗体、5%脱脂奶粉、自封袋、封口机
步骤：①根据抗体说明书以适当比例用5%脱脂奶粉稀释一抗。
②将自封袋剪去封口条，两边剪开，封闭后的PVDF膜小心放入袋内，通常4号袋可放置3~4条膜，膜与膜之间用封口机封好，剪开。
③加入配好的一抗溶液，小心排除气泡，用封口机封口后正面朝上（与凝胶接触的一面）在摇床上4℃过夜孵育或室温孵育1~3h。
④孵育后将膜取出，一抗溶液可回收放置-20℃保存两周回收利用。 ⑤用TBST在摇床上洗膜3次，每次5min以去除残留的一抗。
（六）、二抗孵育
准备：二抗、5%脱脂奶粉、自封袋、封口机
步骤：①用5%脱脂奶粉按二抗说明书以适当比例稀释（1:4000~1:20000）。 ②按一抗孵育的操作给洗过的膜孵育二抗。
③室温摇床孵育2h，孵育后将膜取出，用TBST洗膜3次，每次5min除去残留的二抗。
五、 曝光鉴定
准备：显影液、定影液、自来水、发光液A、发光液B
步骤：①在暗室中将定影液、显影液、自来水分别倒入塑料盘中备用。 ②于一离心管中加入发光液A、发光液B各200μl，混匀。 ③在暗盒内放置一层自封袋，底层可用双面胶粘好，擦净后将漂洗后的膜正面朝上，摆放在塑料膜上，将发光液均匀的滴在PVDF膜上，用另一层塑料膜盖好膜，小心排除气泡。
④在暗室中取出一张X光胶皮，用剪刀剪成适当大小，根据肉眼观察到的荧光强弱调整曝光时间，胶片一旦放上不可移动。 ⑤通过多次曝光以到达最佳效果。曝光完成后打开暗盒取出X光胶片，浸入显影液中不停摇动显影，在红光下观察出现明显条带（一般约1min），立即浸入定影液中（一般约5~10min），以胶片透明为止，用自来水冲去残留的定影液，室温下晾干，胶片保存在干燥阴凉处。
注意：1.若肉眼即可观察到可见荧光，则只需压片1~2s，一般压片时间为5~10min。 2.显影、定影和冲洗可在显影仪中一步进行。
六、扫描及分析
准备：数码相机、Photoshop、Quantity one软件 步骤：①选取效果较好的胶片拍照，导入计算机。
②用Photoshop简单处理图片，转成灰度模式，保存为.tif格式。 ③用Quantity one软件分析条带的光密度值（灰度值）。
Quantity one软件的使用：(1)选取要分析的条带框住，复制粘贴至数目比样品数多1（留有一个框空白背景），方框大小不可改变。
(2)分析光密度值，将结果导入到Excel表中，计算目的蛋白与内参蛋白的光密度比值，制成柱形图。