四 核酸一般的理化性质 ? 核酸的高分子特性 ? 260 nm特征吸收峰
? 核酸的两性性质及等电点: DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5 *关于DNA
1 DNA变性：在某些理化因素作用下，核酸分子互补双链之间氢键断裂，使双
螺旋结构松散变成单链的过程
影响因素：温度、酸碱、有机溶剂、尿素等。 2 增色效应（hyperchromic effect）： 核酸在加热变性过程中260nm波长吸收值（A260）增加。它反映了核酸双链的解链程度。 3 解链曲线（meilting curve）：T/A260关系曲线 解链温度（melting temperature,Tm）:核酸加温变性过程中， A260达到最大值一半时的温度。在Tm时，核酸分子内50%的双链结构被解开。
4 DNA的复性（renaturation）又称退火（annealing）:变性DNA在一定条件下如温度逐步恢复到生理范围内，两条互补链重新恢复天然的双螺旋构象。
复性条件：
温度：缓慢下降至比Tm值低25oC；瞬间降至零度称淬火（quenching） DNA浓度：浓度较高，复性较快
DNA片段大小和复杂程度（最长的不重复序列的长度） 溶液的离子强度、pH等
5减色效应
6分子杂交：不同来源的核酸经变性和复性的过程，其中一些不同的核苷酸单链由于存在局部碱基互补片段，而在复性时形成杂化双链（heteroduplex），此过程称分子杂交。
五 核酸酶（Nucleases） 核酸水解酶 核酸外切酶核酸内切酶（exonuclese） （endonuclease） DNA酶（DNase） 5′端核酸外切酶 限制性核酸内切酶（restriction RNA酶（RNase） 3′端核酸外切酶 endonuclease） 第三章酶 酶的概念：
酶是由生物细胞合成的以蛋白质为主要成分，对底物起高效催化作用的生物催化剂。还有一类具有催化作用的核酸-核酶（ribozyme）或脱氧核酶（deoxyribozyme） 酶的重要性：
第一节 酶的结构与功能
1、单体酶(Monomeric enzyme):
由一条或多条共价相连的肽链组成的酶分子。如:
牛胰RNase 124a.a 单链 鸡卵清溶菌酶 129a.a 单链 胰凝乳蛋白酶 三条肽链
2、寡聚酶(oligomeric enzyme):
由多个相同亚基或不同亚基以非共价键连接组成的酶。如： 苹果脱胱氢酶（鼠肝），2个相同的亚基 琥珀酸脱氢酶（牛心），αβ2个亚基 3、多酶复合体(multienzyme system)
由两个或两个以上的酶，靠非共价键结合而成，其中每一个酶催化一个反应，所有反应依次进行，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。 如：
大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体由三种酶组成： – 丙酮酸脱氢酶（二聚体），共12个酶
– 二氢硫辛酸转乙酰基酶（单体），共24个 – 二氢硫辛酸脱氢酶（二聚体），共6个酶 总分子量：560万
4、多功能酶(multifuctional enzyme)
一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶，往往是进化过程中基因融合的产物。 如:
动物的中脂肪酸合成酶为一条250kD的多肽链，具有7种酶的活性：
乙酰转移酶、转酰基酶、酮脂酰合成酶、酮脂酰还原酶、水化酶、烯脂酰还原酶、硫酯酶
二、酶的分子组成
(一) 金属离子为辅助因子的酶 ? 金属酶（metalloenzyme）：羧肽酶（Zn+2）和黄嘌呤氧化酶（Mo+6）； ? 金属激活酶（metal activated enzyme）：各种激酶和核酸酶（Mg2+）； ? 金属离子的作用：
参与三元络合物起稳定酶蛋白构象和参与酶活性中心起多种催化作用。 E-M-S: 丙酮酸激酶： E- Mg 2+-磷酸烯醇式丙酮酸 E-S-M: 以ATP为底物的激酶： E-ATP-Mg 2+ M-E-S：柠檬酸裂合酶
2、小分子有机化合物的辅助因子 ? 辅基（ prothetic group ）: 与酶蛋白共价结合, 不容易被透析除去，如黄素（FAD和FMN）和生物素等辅基； ? 辅酶（ coenzyme ）:与酶蛋白以非共价键疏松结合, 容易被透析除去，如TPP、NAD等； ? 辅基或辅酶的作用: 传递电子、氢或基团。 三、酶分子的结构： （一）酶的活性中心： 1、活性中心概念：
能结合并催化一定底物使之发生化学变化的位于酶分子上特定空间结构区域，该区域包含结合基团和催化基团，辅助因子参与酶的活性中心。 2、酶活性的必需基团（essential group）
（1）概念：间接或直接与酶催化活性相关的多肽链上某些氨基酸残基的功能基团。 （2）类型：
? 酶活性中心必需基团：
– 结合基团(binding group),结合部位决定酶的专一性，
– 催化基团(catalytic group) 催化部位决定酶所催化反应的性质。
? 活性中心外必需基团：-S-S-
一些酶活性中心的氨基酸残基
酶 残基总数 活性中心残基 牛胰核糖核酸酶 124 His12, His119, Lys41 溶菌酶 129 Asp52, Glu35 牛胰凝乳蛋白酶 245 His57, Asp102,Ser195
牛胰蛋白酶 238 His46, Asp90, Ser183 木瓜蛋白酶 212 Cys25, His159
弹性蛋白酶 240 His45, Asp93, Ser188 枯草杆菌蛋白酶 275 His46, Ser221
碳酸酐酶 258 His93-Zn-His95 His117
（二）酶活性调控部位 （Regulatory site） ? 概念：酶分子中存在着一些可以与其他分子或基团发生共价和非共价结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用。 ? 特点：酶活性调节部位一般位于酶活性中心域外的区域，或位于独立的结构域，或亚基 ? 意义：对酶活性进行快速调节，以适应生命活动的需要 第二节 酶促反应的特点与机制
?一般催化剂的特点酶催化作用的特点酶催化作用的机制 一、一般催化剂的特点
?催化效率高反应前后质量不变催化热力学允许的反应加速可逆反应的进程，不改变反应的平衡点 二、酶促反应的特点：
?酶的高度催化效率（本质）酶的催化具有高度特异性酶的催化受调控酶促反应无副反应
?酶促反应的条件温和 （一）酶的高度催化效率
1、酶与一般催化剂催化效率的比较要高 107-1013 倍 2、酶高度催化效率的机理 （1）反应过程：
例如：过氧化氢分解反应
2H2O2 2H2O +O2
无催化剂 75312 J（18000 cal）
胶态钯 48953 J （11700 cal ） 过氧化氢酶 ? 8368 J （2000 cal ） 1、概念： ? 活化能（activation energy）: 反应物分子从初态转变为过渡态（活化态）分子所需要的能量。 ? 活化分子: 含有较高能量并能起反应的那些分子。 2、加快反应速度的方法：增加过渡态的分子数 ? 供给能量，如加温、光照等 ? 降低活化能
（二）酶的特异性(specificity)：
1、定义：酶只能催化一种或一类底物,或一种化学键，发生一定的化学变化, 生成一定的产物。 2、类型： ? 绝对特异性（absolute specificity）：作用于一种底物进行专一反应生成一种特定产物。如：
? 相对特异性(relative specificity)：作用于一类化合物或一种化学键。 如脂肪酶 、磷酸酯酶和蛋白水解酶等。
? 立体异构特异性(sterospecificity)：只能催化一种立体异构体进行反应，或
产物是一种立体异构体。如：
L-乳酸脱氢酶：作用于L-乳酸（光学异构） 延胡索酸酶：作用于反式丁烯二酸（几何异构） （三）酶的催化受调控
1、酶活性的调节：变构调节、共价修饰和酶原激活 2、代谢物对酶活性的抑制和激活 3、酶含量的调节：诱导、阻遏和降解 4、酶和代谢物的区域化分布
5、多酶体系、多功能酶和同工酶等 二、 酶促反应的机制
（一）酶－底物复合物（中间产物学说） 1、中间产物学说：
E+S ES E+P （三）酶催化作用的机制 3、多元催化
(multielement catalysis)
? 多元催化：多个基元催化形式的协同作用。一般包括酸-碱催化，共价催化（亲
核催化, 亲电子催化）等。如凝乳蛋白酶：Ser-195亲核催化， His-57碱催化等；
? 酸-碱催化：通过暂时提供（或接受）一个质子以稳定过渡态达到催化反应的目
的；
?共价催化（亲核催化, 亲电子催化）：通过催化剂与底物的共价键结合，形成过渡态来加速反应。共价催化具有亲核、亲电过程。
亲核催化：分别带有多电子的原子如O、S和N，可以提供电子去攻击底物上相对带正电子的原子（如羰基碳），即所谓的亲核攻击。 亲电催化：是由亲电试剂(具有接受电子对的原子)引起的催化反应,是亲核催化的反过程
第三节 酶促反应动力学 概念：
? 酶促反应动力学：定量研究酶促反应速度及其影响因素。
? 反应速度：单位时间内底物减少或产物增加的速度，常用初速度来衡量。
影响酶促反应速度的因素：
? 底物浓度[S] 酶浓度[E] 反应温度 pH 值 抑制剂 激活剂
(二)米---曼氏方程
（Michaelis-Menten equation） 1、米-曼氏方程解释：
当[S]<
2、米-曼氏方程成立条件：
? 初速度为标准
? 单底物， [S]>> [E] ? 稳态（steady state）
3、推导方程:
游离酶浓度=[E]-[ES]
ES生成速度=k1（[E]-[ES]）?[S] ES分解速度=k2[ES]+ k3[ES]
当稳态时： ES生成速度=ES分解速度 k1（[E]-[ES]）?[S]= k2[ES]+ k3[ES] （[E]-[ES]）?[S] k2+ k3
[ES] k1 [ES]=
因v=k3[ES],当所有E被S饱和时，即达到最大速度，此时[ES]=[E]，Vmax=k3 [E] 代入上式：
（三） Km与 Vmax的意义
1、Km值等于最大反应速度一半时的底物浓度；
2、 k2??k3 时Km可用来表示酶对底物的亲和力大小， Km与酶对底物亲和力大小成
反比；
3、 Km值是酶的特征性常数之一， Km值范围在10-6 ~
10-2mol/L
4、 Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度呈正比；
5、 k3为酶的转换数(kcat,turnover number)：当酶被底物充分饱和时，单位时间内