第5课时 微生物的实验室培养(二)
[学习导航] 1.通过阅读教材P16～17“(一)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基”，掌握配制培养基的步骤和倒平板操作的过程。2.结合教材P18～19“(二)纯化大肠杆菌”，理解并掌握利用平板划线法和稀释涂布平板法来纯化微生物的方法。
[重难点击] 1.掌握制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法。2.学会用平板划线法和稀释涂布平板法纯化微生物。
一、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
牛肉膏蛋白胨固体培养基是细菌培养中常用的一种培养基，大肠杆菌的纯化就是用的该培养基。
1.牛肉膏蛋白胨培养基的成分及各成分提供的营养
培养基组分 牛肉膏5.0 g 蛋白胨10.0 g NaCl 5.0 g 蒸馏水定容至1 000 mL
2.制备步骤 (1)培养基的配制
计算：根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算配制100 mL培养基时各成分的用量 ↓
0.5 g牛肉膏：比较黏稠，用称量纸称取??1 g蛋白胨：易吸潮，要迅速称取?牛肉膏也是?称量?0.5 g NaCl
??2 g琼脂↓
提供的主要营养物质 碳源、氮源、磷酸盐和维生素 碳源、氮源和维生素 无机盐 氢元素、氧元素
? ↓加热溶化后取出称量纸?加蛋白胨和
NaCl
? ↓微火加热、不断搅拌溶化?溶解后加琼脂?需不断用玻棒搅拌，防止琼脂糊底
? 而导致烧杯破裂? ↓??熔化后，补加蒸馏水至100 mL
↓ ↓
分装：趁热分装到洁净锥形瓶中 ↓
加棉塞：用棉花不用脱脂棉，脱脂棉吸水 ↓
包扎：外包牛皮纸，且挂标签
?①培养基：高压蒸汽灭菌?(2)灭菌?
?②培养皿：干热灭菌?
牛肉膏和称量纸＋水
调节pH：1 moL的NaOH、pH试纸，将pH调为7.4 ～7.6
(3)倒平板
①将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。 ②右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。
③用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。
④等待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。
1.填表比较溶化时两次使用玻棒搅拌的目的
操作 往烧杯中加入蛋白胨和氯化钠后用玻棒搅拌 加入琼脂，加热使其熔化的过程中使用玻棒搅拌
2.倒平板时的注意事项
(1)培养基灭菌后，需要冷却至50 ℃左右时，才能倒平板的原因是什么？你用什么办法来估计培养基的温度？
答案 琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，倒平板时高于50 ℃则会烫手，
搅拌的目的 促使蛋白胨和氯化钠溶解 防止琼脂糊底而导致烧杯破裂
低于50 ℃时若不及时操作，琼脂会凝固。可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。 (2)分析下图，回答①、②问题：
①为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
答案 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
②从防止杂菌污染的角度思考，平板冷凝后将平板倒置的原因是什么？
答案 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。 (3)怎样判断制备的培养基是否合格、成功，是否受到污染？
答案 未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染。
1.某学校开展大肠杆菌培养活动，首先对实验室进行清扫和消毒处理，然后准备各种原料和用具。请回答下列问题：
(1)对买回来的菌种进行扩大培养，首先制备试管培养基，写出制备牛肉膏蛋白胨固体培养基所需的原料： 。 (2)微生物在生长过程中对各种成分需求量不同，配制培养基时各成分要有合适的 。在烧杯中加入琼脂后要不停 ，防止 。
(3)将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干支试管一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入 中灭菌。灭菌完毕后拔掉电源，待压力表的压力自然降到0时，将试管取出。如果棉塞上沾有培养基，此试管应 。 答案 (1)牛肉膏、蛋白胨、蒸馏水、NaCl、琼脂
(2)比例 搅拌 琼脂糊底引起烧杯破裂 (3)高压蒸汽灭菌锅 废弃
2.制备各种牛肉膏蛋白胨固体培养基，关于倒平板的具体描述正确的是( )
①待培养基冷却至40 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板 ②将灭过菌的培养皿放在桌面上，左手拔出棉塞 ③右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰 ④用左手的拇指和食指完全打开皿盖 ⑤右手将锥形瓶中培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖 ⑥等待平板冷却5～10 s，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上 A.①③④⑤ B.④⑤⑥ C.③⑤ D.①②④⑥
问题导析 (1)培养基灭菌后，需冷却至50 ℃左右时才能倒平板，原因是琼脂在44 ℃以下凝固。
(2)倒平板的过程要在酒精灯火焰附近进行。 答案 C
解析 琼脂是一种多糖，在98 ℃以上可溶解于水，在44 ℃以下凝固，倒平板时高于50 ℃则会烫手，低于50 ℃时若不能及时操作，琼脂会凝固。无菌操作应贯穿于操作的全过程，皿盖全打开则空气中的微生物会进入培养基。等待平板冷却凝固(大约需5～10 min)后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。 一题多变
倒平板的过程需要进行无菌操作，在培养基的制备过程中，还有哪些环节需要进行无菌操作？ 答案 要对培养基进行高压蒸汽灭菌，对培养皿进行干热灭菌，酒精灯火焰旁属于灼烧灭菌。
二、微生物的分离与纯化技术
1.纯化大肠杆菌 (1)平板划线法
①原理：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。 ②步骤
接种环灭菌：将接种环放在酒精灯火焰上灼烧直至烧红 ↓
a.在酒精灯火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞??b.将试管口通过火焰达到消灭试管口杂菌的目的取菌种?c.将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液??d.将试管口通过火焰，并塞上棉塞↓
? 接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，?
盖上皿盖。注意不要划破培养基。
平板?b.灼烧接种环，待其冷却后，从第一划线? 区域划线的末端开始往第二区域
? 内划线。重复以上操作，完成三、 四、五区域内划线。注意不要将?? 最后一区的划线与第一区相连
↓
a.左手将皿盖打开一条缝隙，右手把沾有菌种的
培养：将平板倒置，放入培养箱中培养 ?2?稀释涂布平板法
①原理：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。 ②步骤
Ⅰ.系列稀释操作
a.编号为101～106试管中分别盛有9 mL水。
b.用移液管吸取1 mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中，得到稀释菌液。
c.从101倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入102倍稀释的试管中。依次类推，完成菌液的稀释。
注意 移液管要经过灭菌，并且操作应在酒精灯火焰附近完成。 Ⅱ.涂布平板操作
涂布器消毒：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中 ↓
取菌液：取少量菌液滴加到培养基表面 ↓
涂布器灭菌：将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，
冷却8～10 s
↓
涂布平板：用涂布器将菌液均匀涂布在培养基表面，涂布时可转动培养皿，
使菌液分布均匀
2.菌种保藏 比较项目 适用范围 培养基 保藏温度 具体方法 临时保藏 频繁使用的菌种 固体斜面培养基 4 ℃ 接种到固体斜面培养基上→适宜温度下培养→4 ℃冰箱中保藏 甘油管藏 长期保存的菌种 液体培养基 －20 ℃ 甘油瓶中装入甘油后灭菌→将菌液转移至甘油瓶中→混匀后冷冻箱中保存
1.平板划线操作注意事项
(1)平板划线法接种菌种时，哪些操作可防止杂菌污染？
答案 ①接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。②划完一个区域后，将接种环灼烧，冷却后再划下一区域。③接种环沾取菌液时，要将试管口、棉塞等通过火焰。④划线时将培养皿打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内。 (2)在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 答案 避免接种环温度太高，杀死菌种。
(3)为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？
答案 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。
(4)在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
答案 需要。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
(5)在做第二次划线以及其后的操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
答案 划线后末端含有的细菌数目较少，每次从上一次的末端开始划线能够使细菌的数目随划线次数的增加而逐渐减少，最终分散成单个的细菌。 (6)为何最后一次划线不能与第一次划线相连？
答案 最后一次划线已经将细菌稀释成单个的细胞，如果与第一次划线相连则增加了细菌的数目，得不到纯化的效果。 2.稀释涂布平板操作注意事项
(1)涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想将菌液滴加到培养基上时应如何进行无菌操作？
答案 应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适，吸管头不要接触任何其他物体，吸管要在酒精灯火焰附近等。
(2)操作结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个接种的培养基放在一起培养？未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键。如果有菌落生长，说明了什么？
答案 培养未接种培养基的作用是对照。未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的；若有菌落生长，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染，需要重新制备。
归纳总结 两种接种方法比较