足够的序列。所得序列通过与参考基因组比对或从头组装(denovoassembling)形成全基因组范围的转录谱。试验流程,如图1所示。
图1 RNA一eq试验流程
4.1、送样要求
1) 请提供请提供OD260/280介于1.8～2.2之间，浓≥250ng/μl，总量≥40μg的总RNA，并确保RNA无降解，无污染；或提供浓度≥50ng/μl，总量≥400ng的mRNA。
2) 送样管务必标清样品编号，管口使用Parafilm膜密封。 3) 样品保存期间切忌反复冻融。
4) 送样时使用干冰运输。
5) 质检以我方电泳胶图、紫外分析仪定量为准。
6) 请填写完整的送样订单，并提供RNA电泳检测照片，用自封袋密封后随同样品一起送样。
5、序言 转录组技术在生物学、医学、农学中的应用
随着第二代测序技术的迅猛发展，其高通量、快速、低成本的特点成为越来越多的生物学研究者在解决生物学问题时的首选，尤其在转录组测序方面更显示出极大的潜力。转录组（transcriptome）是指特定生物体在某种状态下所有基因转录产物的总和，转录组研究是功能基因组研究的一项重要内容。转录组是连接基因组遗传信息与生物功能（蛋白质组）的必然纽带，同时相对于真核生物全基因组测序来说，转录组测序得到的序列不含有内含子及其它非编码序列，因此转录组测序有着无可比拟的高性价比优势。研究基因组结构的复杂性及遗传语言的根本规律，更需要对测序所得的海量数据进行精准且全面的揭示和分析，于是生物信息学便成为一门迅速兴起的交叉学科，它位于生物、计算机、数学等多个领域的交叉点上，不断深入去探索碱基序列数据背后的生物学意义。目前转录组测序及分析技术可以解决新基因的深度发掘、低丰度转录本的发现、转录图谱绘制、可变剪接的调控、代谢途径确定、基因家族鉴定及进化分析等各方面的问题。转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，已经被广泛应用于生物学、医学、农学等许多领域。 5.1、转录组技术在生物学中的应用
快速获得您感兴趣的细胞、组织或生物体内的mRNA种类及其丰度，帮助您发现由于可变剪接或者可变多聚腺苷化位点选择所产生的新mRNA isoforms；快速获得您感兴趣的不同细胞或者不同组织内的mRNA种类及其丰度，分析mRNA的差异表达信息。通过差异表达基因功能分析，可以发现在细胞分化，特别是胚胎干细胞和神经干细胞分化，机体发育，信号转导等生物学过程中基因表达调控改变的整体特征；如果您希望研究某种基因如何通过改变细胞的基因表达调控网络来发挥其生物学功能，您可以对该基因进行突变、敲除或敲低，然后对照组和实验组的细胞内的RNA-seq分析，通过差异表达分析即可以快速全面获得您需要的信息。
5.1.1、哺乳动物组织的转录组分析
[12]
哺乳动物基因组的巨大性和复杂性给其转录组研究带来严峻挑战。Mortazavi等研究员结合Illumina测序平台，对成年小鼠的脑、肺、骨骼肌组织RNA进行转录组高通量测序及分析，获得1.4亿数据，约90%的位置与已知外显子相匹配，同时也发现了未见报道的序列信息。约3000个新鉴定的3’UTR，可能在microRNA介导的转录后水平和翻译水平调控中起重要作用；约3000个新鉴定的5’外显子，提示有新的启动子序列被利用。尤其在RNA剪接方面，该研究利用高通量测序获得的海量数据，对比到约2×105种可能剪接方式的数据库，鉴定出1.45×105种不同的剪接方式，其中可变剪接占主导，3500个基因拥有至少一种内部剪接方式。该研究成果表明：高通量测序技术不仅能够检测到低丰度转录本，而且可以发现未知转录本，精确识别可变剪接位点，提供全面的转录组信息，这些均是芯片杂交技术或SAGE文库测序技术无法比拟的，是目前深入研究转录组复杂性的有力工具。 5.2、转录组技术在医学中的应用
在癌变和其他复杂疾病发生和发展过程中，细胞内的基因表达模式会发生显著改变。如果您是临床医生或者从事相关研究的科学家，希望快速全面掌握您感兴趣的癌症或者其他疾病发生中基因表达模式的改变，对该疾病的诊断和治疗提供重要解决策略；那么，RNA-seq可以通过对照正常样本和疾病样本中表达模式发生显著变化的基因，及其功能分析快速为您提供正确答案。在细菌和病毒侵染时，细胞内的基因表达模式也会发生显著变化。这些变化对机体的抗感染功能至关重要。如果您是从事相关研究的医生或者科学家，希望快速全面掌握在某病毒或者细菌侵染过程中细胞基因表达模式的改变特征，为有效抵抗病原侵染提供重要解决策略；那么RNA-seq可以通过对照正常样本和侵染样本中表达模式发生显著变化的基因，及其功能分析为您提供正确答案。
5.2.1、癌细胞和组织中的基因融合[13]
2009年美国密歇根大学医学院的Christopher A. Maher等研究者采用转录组高通量测序技术对癌细胞进行测序分析，以期找到新的基因融合。该研究成功“重新发现”了慢性粒细胞白血病细胞中BCR-ABL1 10的基因融合、前列腺癌细胞和前列腺癌组织中TMPRSS2-ERG2基因融合。另外，研究者还验证了在癌细胞和肿瘤组织中导致嵌合转录的新的基因融合（SLC45A3-ELK4）。表征癌细胞中特定基因组失常在确定癌症的治疗目标中有重要的作用，因此确
定诱发癌症的基因失常是癌症研究的一个主要手段。由癌细胞中染色体重新排列而导致的基因融合被认为是一些最普遍的“癌症基因”产生的主要原因。由于它们在致癌过程中的诱发作用和精确地癌细胞局限性，融合基因可以描绘出理想的诊断标记物和合理的治疗目标物。周期性基因融合，与血液恶性肿瘤、罕见骨肿瘤及软组织肿瘤密切相关，并且最近还发现了其在一些常见的实体瘤中的作用，如：前列腺癌和肺癌。Christopher A. Maher等人通过对不同细胞系进行转录组测序及后续的qRT-PCR、FISH、Array CGH或高密度SNP Array的验证，证实了转录组测序对于检测基因融合是一个非常有效地工具。另外，在Christopher A. Maher等人用Illumina GenomeAnalyzer进行转录组测序的研究中，为了消除假阳性数据，克服缺少长读子的深度及减少局部基因定位排列中的短读子的难度，长读子和短读子的序列数据被并入到一起进行分析。结果证明，这种整体化的处理方法极有效地减少了假候选基因并大大增加了试验可行的候选基因的比率。一个重要的局限性则是，当邻侧的两个基因只引起调控序列的融合而不是转录序列的时候，则不能使用转录组测序这个方法。但无论如何，该研究建立了基于转录组高通量测序技术发现新基因融合的可靠方法路线，为系统界定癌症相关突变开辟了重要途径。 5.3、转录组技术在农业中的应用
在植物的正常生长，抗旱、抗逆、以及优良品系培育等过程中细胞的基因表达模式会发生显著变化。如果您是从事农业研究的科学家或农学家，RNA-seq可以通过对照正常样本和您感兴趣样本中表达模式发生显著差异的基因让您快速全面掌握在您感兴趣的植物性状中起重要功能的基因，给力您育种或者相关农业应用研究的进程。
5.3.1、拟南芥可变剪接研究[14]
SergeiA.Filichkin等研究者采用转录组高通量测序技术对拟南芥进行可变剪接分析，发现42%以上具有内含子的基因具备可变剪接形式，这个数据远远高于EST测序方法（20%-30%）。可变剪接转录本多数具有提前终止密码子（PTC+），PTC+可作为无义介导的mRNA降解监控机制（NMD）的靶标，或通过调控非预期剪接和转录机制（RUST）来调控功能转录本水平。该研究还发现在不同环境因素胁迫下，PTC+及相关剪接变体的相对比率会随之发生转变。研究成果还提示，和动物体内类似，NMD和RUST同样在植物体内的基因表达中广泛存在并扮演非常重要的角色。
6、转录组测序技术面临的挑战和展望前景
随着测序技术的不断进步，我们能够对转录组开展更为深入的测序工作，能够发现更多、更可靠的转录子，目前的大规模并行测序技术已经彻底改变了我们对转录组的研究方法，测序结果的质量也在不断提高，得到的信息量也在爆炸式增长。然而和其他所有新生技术一样，RNA-Seq技术也面临着一系列新问题：其一是庞大的数据量所带来的信息学难题，比如如何最好地诠释和比对鉴定多个类似的同源基因，如何确定最佳测序量，获得高质量的转录图谱等[15]；其二是如何针对更复杂的转录组来识别和追踪所有基因中罕见RNA 亚型的表达变化。有可能提前实现这一目标的将是使用配对末端测序和单分子测序等更新的测序技术，以及使用更长的读段来增加测序深度和覆盖度[16]
；其三，目前的高通量测序技术大都需要较多的样品起始量，这使得来源极为有限的生物样品分析受到限制，因此如何对单细胞或少量细胞进行转录组测序是一个亟待解决的问题。最近这方面的研究也取得了一定进展，如Tang等[17]建立了一种mRNA-Seq 方案，它以PCR为基础扩增单个细胞的mRNA 转录组，成功分析了取自小鼠四细胞胚胎时期的单个卵裂球的转录组。然而该方法只能捕捉带有poly(A)尾巴的mRNA，也不能检测绝大多数较长的mRNA(大于3 kb)的5′末端, 同时也不能保留原转录子的方向信息。除此之外还有一些新的针对低数量细胞进行转录组研究的技术正在不断被开发[18]。最后，标准的RNA-Seq技术不能提供序列转录的方向信息，而这对于转录组注释尤为重要，采用single-strand sequencing[19]和strandspecificsequencing[20]技术能很好的解决这一问题,或将成为RNA-Seq 技术发展的一个重要方向。虽然RNA-Seq技术还面临着种种困难，但作为一个刚刚起步的新技术RNA-Seq已经显示出其他转录组学技术无可比拟的优势：既能提供单碱基分辨率的转录组注释又能提供全基因组范围的“数字化”的基因表达谱， 而且其成本通常比芯片和大规模的Sanger EST测序要低,有人甚至提出了RNA-Seq 最终取代基因芯片的猜测。然而就目前来看，作为两个高通量的转录组学研究技术，在应用的某些方面既存在重叠和竞争也存在优势互补，一种技术能弥补另一种技术遗漏的部分, 通常对一个生物学问题的回答需要不同实验技术的协同配合，例如序列捕获(Sequence Capture)技术就是结合了芯片和深度测序，利用芯片探针捕获待测片段，再用深度测序技术分析核酸序列。但基因芯片的缺点，就在于它是一个“封闭系统”，它只能检测人们已知序列