植物组织培养实验指导
2012.3
附录 培养基母液的配制
一、实验目的：掌握培养基母液配制的方法。
二、实验原理：配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即将所选培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。以MS培养基为例，所需配制的母液可分为：MS大量元素母液、MS微量元素母液、MS铁盐母液和MS有机化合物母液等。另外，还要配制生长物质母液，在不同类型的培养基中使用。 三、实验器具与药品：
电子分析天平、托盘天平、烧杯（50ml, 100ml, 500ml, 1000ml）、量筒（1000ml,100ml, 25ml）、容量瓶（1000ml,500ml,100ml）、药勺、称量纸、玻璃棒、滴管、电炉、冰箱。
配制MS培养基所需药品按培养基的配方准备。植物生长调节物质，2,4-D, NAA, 6-BA等。
四、培养基母液的配制过程
首先，按下表“MS培养基母液的配制”，将各种母液根据各自的扩大倍数，计算出扩大后的称取量，然后，分别进行药品称取和母液配制。 母液种类 成分 规定用扩大 称取量母液定配1LMS量ml/L 倍数 mg 容体积 培养基吸 ml 大量元素 KNO3 NH4NO3 MgSO4·7H2O KH2PO4 CaCl2·2H2O 4H2O 微量元素 MnSO4·ZnSO4·7H2O H3BO3 1900 1650 370 170 440 22.3 8.6 6.2 20 38000 33000 7400 3400 8800 22300 8600 1000 1 1000 取量ml 50 1000 6200 2
KI Na2MoO4·2H2O CuSO4·5H2O CoCl2·6H2O 铁盐 Na-EDTA FeSO4·7H2O 维生素和烟酸 氨基酸 甘氨酸 Vit.B1 Vit.B6 肌醇 0.83 0.25 0.025 0.025 37.3 27.8 0.5 2.0 0.1 0.5 100 100 830 250 25 25 3730 2780 25 100 100 5 25 5000 1000 1000 10 10 （1） MS大量元素母液的配制
按照MS培养基配方的用量扩大20倍，将大量元素配制成20倍的母液。配制时先用量筒量取蒸馏水800ml，放入1000ml的烧杯中，依次分别称取KNO3 38g; NH4NO3 33g, MgSO4·7H2O 7.4g, KH2PO4 3.4g, CaCl2·2H2O 8.8g，按顺序先后倒入烧杯中，用玻璃棒搅动，待第一种化合物溶解后再加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液倒入1000ml的容量瓶，用蒸馏水定容至1000ml,然后，倒入细口磨砂试剂瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名、置于4℃冰箱保存备用。配制培养基时每升MS培养基吸取该母液量为50ml。 （2） MS微量元素母液的配制
将MS培养基配方中微量元素的无机盐用量分别扩大1000倍，用电子天平分别依次称取MnSO4·4H2O 22.3g， ZnSO4·7H2O 8.6g , H3BO3 6.2g，KI 0.83g，Na2MoO4·2H2O 0.25g，CuSO4·5H2O 0.025g，CoCl2·6H2O 0.025g，并用重蒸水逐个溶解，待全部溶解用容量瓶定容后，装入1000ml倒入细口磨砂试剂瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名、置于4℃冰箱保存备用。配制培养基时每升MS培养基吸取该母液量为1ml。 ( 3 ) 铁盐母液的配制
在电子天平上准确称量2.78g硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)和3.73g乙二胺四乙酸钠(Na-EDTA),分别倒入盛有400ml蒸馏水的烧杯中，微加热并不断搅拌使之全部溶
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解。将两种溶液倒入同一个1000ml的容量瓶中，混合均匀后，用蒸馏水定容至1000ml，并倒入棕色磨口试剂瓶中，经室温放置一段时间令其充分反应后，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名、置于4℃冰箱保存备用。如果将新配制的铁盐母液立即放入冰箱中。则会容易形成沉淀。配制培养基时，每配制1000mlMS培养基吸取此母液10ml。 ( 4 )MS有机母液的配制
用电子天平依次称取：肌醇（环己六醇）5000mg，盐酸硫胺素（维生素B1）5mg，烟酸25mg，甘氨酸100mg，盐酸吡哆醇（维生素B6）25mg，用蒸馏水依次溶解并定容后，装入500ml的磨口瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名，置于4℃冰箱保存备用。配制培养基时，每配制1LMS培养基吸取该母液10ml。
（5）植物生长物质母液的配制
? 2,4-D母液：准确称量2,4-D 50mg，先用1~3ml90%乙醇完全溶解后，加蒸馏水定容；也可以用少量碱（如1mol/氢氧化钾、氢氧化钠）溶液，使之中和成为钠盐或钾盐，在水中溶解，再加水定容至100ml，即配成浓度为500ml/L的母液。贴上标签，注明名称、浓度和配制日期，放入4℃冰箱保存。NAA母液的配制过程与2,4-D相同。
?6-BA母液：准确称量50mg 6-BA，加入少量碱溶液（如1mol/氢氧化钾、氢氧化钠）或稀碱液（1mol/L盐酸）溶液使之完全溶解后，加蒸馏水定容至100ml，即配制成浓度为500mg/L的6-BA的母液。转入磨口试剂瓶中，并贴上标签，注明母液名称、浓度和配制日期，放入4℃冰箱保存备用。 五、注意事项
在配制大量元素母液时，混合、溶解各种无机盐时要注意先后顺序，尽量把Ca2+，SO42-,PO43- 等离子错开分别溶解，同时稀释浓度要大些，并要慢慢地边混合边搅拌。
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实验一 MS培养基的配制与灭菌
一、实验目的：学习用母液法配制MS培养基以及掌握培养基灭菌的方法及操作过程。
二、实验原理：组织培养所用的培养基含有植物细胞生长所必需的各类营养物质，同时也是各种细菌、真菌滋生繁殖的极好场所。因此必须对培养基进行灭菌处理，一确保无菌操作的顺利进行。 三、实验器材及试剂：
①器材：电子天平、托盘天平、烧杯（50ml, 100ml, 500ml, 1000ml）、量筒（1000ml,100ml, 25ml）药勺、称量纸、玻璃棒、移液管（10ml, 5ml, 2ml, 1ml,0.5ml,0.2ml）、电炉（1000W）、石棉网、吸耳球、酸度计或pH试纸（5.0~7.0）、三角瓶（50ml,100ml）或果酱瓶、耐高温高压的专用封口膜、线绳、冰箱、手提式消毒灭菌锅或卧式电压力灭菌锅
②试剂：蔗糖、琼脂、活性炭、1N HCl、1N NaOH；2,4-D、6BA等植物激素母液及MS基本培养基母液。 四、实验步骤 （1）培养基的配方
本次实验分成三组，每组配制一种培养基，各组所配制的培养基如下： A 胡萝卜块根愈伤组织诱导培养基：
MS+2,4-D（1mg/L）+蔗糖（30g/L）+琼脂（8g/L） pH6.0
配制1-1.5L用小果酱瓶分装30-35瓶，另：需要无菌水每人两瓶（大果酱瓶）、纱布5块、碟子每人一个（30-35个），用报纸包好一同灭菌。 B 香蕉芽的继代生芽培养基：
MS+6BA（5mg/L）+IBA（0.1mg/L）+蔗糖（30g/L）+琼脂（8g/L） pH6.0 配制2-2.5L用小果酱瓶分装60-65瓶，即每人两瓶，另：需要纱布5块、碟子每人一个（30-35个），用报纸包好一同灭菌。 C 香蕉芽苗的生根培养基：
1/2MS+蔗糖（30g/L）+琼脂（8g/L）+活性炭（1g/L）pH6.0
配制1.5L用大果酱瓶分装30-35瓶，另外：纱布5块，碟子每人一个（30-35个），用报纸包好一同灭菌。
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