MTT法测定实验过程及注意事项

2020-03-27 09:01

小鼠淋巴细胞增殖及白介素2活性测定

1. 动物分组与给药:略 2. 药品及试剂:

RPMI-1640完全培养液:含10%胎牛血清的1640基础液

RPMI-1640基础液:10.4g粉末加入1000ml超纯水中,加2gNaHCO3,加入双抗储液,调pH到7.2左右,过滤除菌,盐水瓶分装,封口膜封口,4℃保存(需较长时间保存则放入-20℃;若4℃保存则放置时间超过一周需补加L-谷氨酰胺)

双抗储液:青霉素为80万单位/瓶,用注射器加4ml超纯水;链霉素为100万单位/瓶,用注射器加5ml超纯水,即每毫升各为20万单位。使用时各取0.5ml加入1L培养基中过滤除菌即可。(青链霉素的工作浓度为100单位/ml),如果买的是配好的双抗时,加10ml就可以

胎牛血清:-20℃保存,使用前需56℃水浴灭活30min;分装,避免反复冻融;使用时逐步解冻,即先从-20℃转至4℃冰箱过夜,再放至室温。可以照紫外。

强酸洗液:重铬酸钾120g 浓硫酸200 mL 蒸馏水1 000 mL(按比例配置) MTT:用PBS(pH=7.4)配成5 mg/mL,过滤除菌,1.5ml离心管分装,封口膜封口,-20℃保存,一定要避光保存

PBS:NaCl 8.0g, KCl 0.2g,Na2HPO4·H2O 1.56g ,KH2PO4 0.2g 加双蒸水至1000ml,调PH至7.4,高压灭菌,4℃保存

DMSO:冬天温度低时形成结晶,需水浴加热后使用,且控制房间温度;离心时注意温度,不要使用低温离心,否则96孔板温度低,DMSO加于其中后会析出晶体

需泡酸处理的东西有:培养皿 培养瓶 离心管(50ml、10ml、1.5ml) 枪头 玻璃棒 烧杯(1000ml、250ml) 盐水瓶 量筒(筛网和培养瓶盖子绝对不可以泡强酸!) 需高压的东西有:培养皿 培养瓶,枪头(三种规格)

需准备的其他东西还有: 75%酒精 培养皿 培养瓶 培养板 离心管(8ml 1.5ml ) 计数板 盖玻片,滤菌器 枪头(三种规格) 枪头盒 5ml /10ml注射器 烧杯 盐水瓶 量筒 废液缸 标签 记号笔 1.5ml计数用离心管 毛细管 生理盐水(计数稀释用) 新洁尔灭 桶 手套 口罩 称量纸(灭菌) 酒精棉 酒精灯 锡箔纸 饭盒 试管架 紫外消毒

注意:1. 盐水瓶盖子、培养瓶盖子绝对不可以泡强酸,可泡75%酒精消毒,再用蒸馏水洗干净后放入饭盒或者用牛皮纸包好高压灭菌

2. 所有接触细胞的东西包括培养皿、培养瓶等等玻璃仪器均须泡强酸洗液;用于配液及分装的盐水瓶、大小离心管、玻璃棒、烧杯、量筒等等也须泡强酸洗液

3. 冷冻离心机须提前预冷

4. 每次实验前须注意房间的紫外、过滤装置等等

5. 所有带入培养间的东西需紫外,放入超净台的东西需洁净,最好瓶子外表都用75%酒精擦洗 3.方法:

做好一切准备工作,取出细胞放入8ml离心管,放入冷冻离心机内离心,1000转6分钟,缓缓倒出上清(或吸出上清),加入新鲜培养基(定量,因为用于计数),.轻轻吹打,制得细胞悬液,取出20μl放入dov管内,dov管内的用于计数,8ml离心管的离心。8ml离心管同样倒出上清后,根据计数结果,稀释到2*105个/ml,用于种板。一般一块96孔板需要20ml细胞悬液

药物要用1640培养基溶解,先配一个储备溶液,滤菌后,然后稀释到自己需要的浓度。 种板子时,先设计好板子,然后根据自己设计好的加药物,细胞悬液。先加药物,后加细胞。种板子时,如果是空白药物或者是纯细胞(阴性对照)时,要加200μl,其余的一般是药物加50μl,细胞加150μl。加完后放入CO2培养箱内培养44个小时,然后每个孔

加10μlMTT,培养4个小时,取出离心,2000转10/15分钟,吸出每孔上清,然后加150μlDMSO,振荡10分钟(振荡10次,每次1分钟),再放置10分钟,在酶标仪上检测每孔吸光度。波长492nm


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