杀虫剂生物测定技术
摘要：杀虫剂的生物测定是利用昆虫、螨类对杀虫剂的反应，来鉴别某种农药或化合物的生物活性。是测定农药对昆虫、螨类毒力与药效的一种基本方法。它涉及靶标生物、测试物质(药剂)、反应症状及强度、测试环境条件等多方面的因素。一个好的生物测定技术或方法应具备易于操作、结果反应灵敏、重现性好、且使用物质的剂量与反应之间有良好的相关性。 关键词：杀虫剂 测定农药 生物测定技术
随着农药科学及其农药工业的迅速发展，农药生物测定作为新农药
创制和合理科学使用农药以及农药药理学、毒理学及环境毒理学等研究的重要手段，得到了极大的丰富和发展。杀虫剂的生物测定是利用昆虫、螨类对杀虫剂的反应，来鉴别某种农药或化合物的生物活性。是测定农药对昆虫、螨类毒力与药效的一种基本方法。它涉及靶标生物、测试物质(药剂)、反应症状及强度、测试环境条件等多方面的因素。一个好的生物测定技术或方法应具备易于操作、结果反应灵敏、重现性好、且使用物质的剂量与反应之间有良好的相关性[1、2]。
1、杀虫剂生物测定的基本原理和方法
在杀虫剂生物测定研究中，靶标生物的种类、发育阶段和生理状态等对农药的毒力或药效影响很大；药剂本身的理化特性、加工剂型、助剂种类与含量等也影响药效；而测试环境条件对靶标生物以及靶标生物对药剂的反应程度也存在根大的影响。环境条件、供试药剂、靶标生物三者之间相互作用，相互影响。所以，在进行杀虫剂生物测定试验时，必须严格控制各种影响因子，以确保试验结果的可靠性，可比性以及重现性。在设计和进行杀虫剂生物测定试验研究时，必须掌握和了解以下基本原则[3]：
1.1标准化靶标试材的选择及繁育
不同靶标生物对药剂的反应各不相同，原则上任何生物体或其活体器官、组织、细胞等均可以作为生测靶标选择或用于测试。在杀虫剂生物测定研究中，靶标生物的选择应具备以下几个条件：①在分类学上，经济上或地域上有一定代表性的昆虫。②对药剂敏感性符合要求，且对药剂的反应以及程度便于定性、定量
测定，且与剂量有良好的相关性。⑧易于移取、控制和进行试验操作。④易于大规模工业化培养、繁育和保存，以便保证终年供给。不受地区或季节的限制而影响试验的开展。⑤种群纯正，个体间差异小，生理标准均一。
1.2明确药剂的结构、组成及其有效成分含量
所有测试试验的物质均应是纯品或原药(原油或原粉)，结构明确：若为制剂应了解确切的有效成分含量，若有添加剂和助剂也应了解其成分和含量：以保证试验的重现性。并且，应使用精密的施药机械和正确的使用技术，以确保靶标受试药量的准确性和均一性。
1.3严格控制的、相当均一的环境条件
杀虫剂生物测定大部分是测定靶标生物的反应程度(死亡率)，随药剂剂量的变化关系。药剂剂量(或浓度)为自变量，对靶标死亡率为因变量。在没有其它因子影响的情况下，二者里良好的正相关关系，其试验结果也便于测定和分析。而在生测试验中，环境条件(如光照、温度、湿度等)不仅影响靶标生物的生理状态，也影响药剂的吸收、输导以及毒力或药效的高低。所以在进行生测试验时，应严格控制测试环境，以保证所有处理在相对一致的环境下测试。室内试验可以在人工气候箱、光照培养箱、恒温、恒湿箱中进行。田间试验应选有代表性的田块，最好有相对控制的小气候环境，田块平整，肥力均一，虫害分布均匀且有代表性，作物长势、管理条件等均力求一致，以减少试验误差[1]。
1.4必须设立对照
由于生物的复杂性和易变性，常会产生一些难以预料的结果，所以，正确设立空白对照，对于取得可信的试验数据非常重要。一般常用杀虫剂生物测定试验的对照设立有3种：①不作任何处理的空白对照。以了解供试靶标生物的自然死亡率、生物量变化等．消除供试生物本身的变化对测定结果的影响。②不含有效成分的对照。即除不含农药有效成分外，一切处理均与其它药剂处理一样进行，主要目的是了解溶剂、乳化剂、助剂等以及处理方法对测试靶标的影响。③标准药剂对照。即选择同类已知对测定靶标有明确影响的化含物或商品化品种作对照，以消除偶然因素的影响，同时也便于比较和评价未知供试化合物的活性。在新化合物筛选试验或其它长期进行的试验中，用于监测靶标生物的生理状态变化
以及耐药性水平的变化趋势，以跟踪和消除不同批次试验间的误差。
1.5设置重复，随机排列
生物测定试验的对象是靶标生物，而靶标生物种群中个体之间的大小、生理状态以及耐药性等均存在一定的差异。在生测试验取样时，应有一定的数量，并设置重复，以保证其代表性和结果的可靠性。但重复也不能过多，应根据试验的目的和工作量确定重复次数。一般试验至少应重复3次，田间小区试验应重复4—5次。’其试验设置应用随机区组法排列，以控制处理间的误差，并便于对调查数据进行统计分析。
1.6应用生物统计的方法分析试验结果
对试验结果用生物统计工具进行比较和分析，对于消除试验误差，了解错纵复杂的大量数据之间的内在规律，揭示供试化合物与靶标之间的内在关系等非常重要。尤其是目前计算机的普及和许多生测统计软件的应用，使得生测试验的统计分析、数据处理和保存更加方便和快捷。
2、杀虫剂的生物测定方法
2.1杀虫剂毒力测定方法
杀虫剂的毒力测定方法很多，根据试虫、供试化合物以及测定目的不同，可以选用不同的试验方法或自行设计试验方法和技术，常用的新化合物杀虫活性筛选方法和杀虫剂作用方式测定方法有以下几种[4.5]：
初步杀虫活性测定比较或筛选试验方法：这类方法主要用于确定或比较供试化合物是否具有杀虫活性及其活性高低，多用于筛选试验和毒力或药效比较试验。主要有3类常用方法：
2.1.1喷雾(粉)法：利用喷雾或喷粉装置，将定量的药剂直接喷布于盛有目标昆虫及其饲料的器皿内，使药剂直接与昆虫或食料接触，然后在培养箱或观察室内定期观察记录昆虫的生长、发育和死亡情况，比较或确定化合物的毒力。这类试验对喷雾装置的要求较高，要求雾滴大小基本一致，喷雾均匀，单位面积上药剂沉积量一致。常用喷雾装置有履带式或天车式喷雾机、喷雾喷粉两用沉降塔、颇特喷雾器等。其特点是速度快、便于操作、用药量准确；但需特定设备。
2.1.2浸渍法：将一定数量的目标昆虫(用于净纱布袋或纱笼装起来)，或将
饲料植株、叶片或带虫叶片(如蚜虫、红蜘蛛等)，直接浸润于一定浓度的药液中3—5秒钟，取出后用滤纸吸去多余药液，将试虫及饲料置于干净器皿中饲养，并补充新鲜饲料，观察、记录试虫死亡率[7]。
特点是快速、方便、不需特殊仪器、设备，但操作中人为因素影响大，用药量不够准确。
2.1.3饲料混药法：将一定量的药剂充分与试虫食料混匀，试虫取食时接触或摄入药剂而死亡。多用于贮粮害虫、家蝇、蜚蠊、蚊子或人工饲料饲养的昆虫的生物测定试验。
上述方法比较粗放，主要用于判断化合物是否有杀虫活性，并初步比较其活性大小，多用于常规筛选研究。如目前大部分研究机构采用喷雾法或浸渍法筛选新化合物的杀虫活性。
2．2杀虫剂作用方式测定方法
了解杀虫剂的作用方式，对于准确评价其杀虫活性以及正确有效地使用杀虫剂具有十分重要的意义。通常根据杀虫剂进入虫体的部位和途径，将杀虫剂可分为胃毒剂、触杀剂、熏蒸剂、内吸剂、忌避与拒食剂、不育剂、引诱剂等。椐其不同的作用方式可以选择或设计相应的生物测定技术。 2.2.1胃毒作用测定
使供试药剂随食物一起被目标昆虫吞食进入消化道而发挥毒杀作用。常用方法有：
（1）无限量取食法培养基混药法：①饲料混药饲喂法：如贮粮害虫测定等。②人工饲料饲喂的昆虫等，如果蝇。③土壤混药饲虫法：以金针虫、蛴螬、蝼蛄、地老虎等地下害虫，土地混药后接虫。
（2）定量取食法：①一叶片夹毒法：利用喷粉(雾)或点滴法定量制做夹毒叶片。②液滴饲喂法：家蝇、果蝇、蜜蜂等舐食性昆虫。③口腔注射法：难度大，很少使用。
无限量取：A、直接施药法：①喷粉或喷雾法：定量药液直接喷布至虫体。②浸渍法：筛选试验。蚜虫、螨等小型不活动昆虫。③浸玻片法：螨、蚜虫测定。B、局部施药法：①药膜法：爬行昆虫、卫生害虫。②点滴法：用药精确、应用广泛[6.7]。
[1]
无限量食法操作方便，易于大规模进行试验，但很难排除其它毒杀作用(如触杀、熏蒸等)的影响。定量取食法测试结果EE较准确，且便于对昆虫的取食药量进行定量分析，如夹毒叶片法是目前常用的测定胃毒作用的经典技术。 2.2.2触杀作用测定
药剂通过昆虫体壁进入虫体而产生毒杀作用——触杀毒力。其测定方法有直接施药法和局部施药法：
(1)直接施药法: ①粉或喷雾法,定量药液直接喷布至虫体。②浸渍法：筛选试验,蚜虫、螨等小型不活动昆虫。③浸玻片法：螨、蚜虫测定[6.7]。
(2) 局部施药法: ①药膜法：爬行昆虫、卫生害虫。②点滴法：用药精确、应用广泛[8]。
直接施药法常无法排除胃毒等的干扰，但主要为触杀作用。 2.2.3熏蒸作用测定
测试杀虫剂从气孔或气门进入呼吸系统而引起昆虫中毒，．测定时应注意密闭以及温度、湿度的影响。常用方法二重皿法、广口瓶法、三角瓶法等；也可用钟罩、干燥器等进行试验。 2.2.4内吸作用测定
内吸杀虫剂指通过植物根、茎、叶及种子等部位渗入植物内部组织，随体液传导至整株，而对害虫起很高毒效的化学物质。测定方法很多，也可以自行设计。如根系内吸、叶部内吸、茎叶内吸和种子内吸等[9]。 2.2.5昆虫拒食活性的测定
昆虫拒食剂，简单地讲，就是可以干扰或抑制昆虫取食行为的物质。 近年来，拒食作用机理的研究进展很快。昆虫的嗜食性基本上是由位于昆虫的触角、下颚须、下唇须上的感化器功能所决定的，感化器将食物的特性转变成电信号传入中枢神经系统，从而决定取食与否。拒食剂的作用可能正是干扰了这些感化器的正常功能。
目前，国内外广泛采用的测定拒食活性的主要方法有4种：叶碟法及改良叶碟法、体重法、排泄物质法及电讯号法。
(1)选择拒食活性：将处理叶碟和2张对照叶碟交错放入一个培养皿；在培养皿中央放进一头饥饿的试虫。要求试虫龄期一致、个体大小近似。