七项呼吸道病毒实验操作步骤-鉴定

2020-03-27 20:15

7项呼吸道病毒试剂盒操作流程

1、取样:(此步骤大多由临床医生完成。)

用特制的鼻咽拭子从病人的鼻咽部取样或者使用鼻腔灌洗液,将鼻咽拭子放入储存管中(含有缓冲液)。使用鼻咽拭子取样时,拭子进入鼻部后,应水平向鼻腔伸入。伸入的深度约为耳垂到鼻尖的二分之一处,取样前可事先大致测量一下。二岁一下的儿童,伸入深度约为拭子绒毛长度的二倍。拭子伸入至指定深度后,缓缓贴壁旋转2-3周,约停留10秒钟,取出拭子。取样后一小时内向取样管中加入生理盐水,样本最好在24小时内进行操作。

2、样本准备步骤:(此步骤除离心以外,建议都在二级生物安全柜内操作) ①将样本充分震荡混匀约10-15秒。 ②在3000rpm转速下离心10分钟。 ③弃上清。

④在沉淀中加5 mL PBS缓冲液(请使用普通PBS,不要使用试剂盒内配套的浓缩洗液),充分震荡混匀约10-15秒。 ⑤在3000rpm转速下离心10分钟。 ⑥吸走上清和黏液层,小心不要吸到沉淀。 ⑦重复步骤4到6,直至黏液层被完全去除。

注意:一定要将黏液去除干净,否则会造成非特异荧光从而影响实验结果。以看不见粘液为准。一般重复两到三次即可,若肉眼不可粘液,洗一次即可。 ⑧在沉淀中加0.5到1 mL的PBS缓冲液。视沉淀的量而定,若无可见沉淀则加入0.2mL.

⑨用移液器反复吹吸来重悬细胞沉淀,形成一个略混浊的悬液。这个悬浊液可用于直接样本测试。

3、直接样本测试步骤:

在操作前请将试剂盒内40×的高浓缩洗液稀释40倍后使用。

①在8孔板上的每孔内滴加25 μL的细胞悬浊液。(若在之前步骤清洗沉淀中可明显见大块沉淀,则滴加15μL细胞悬浊液即可。

②样本完全风干。风干时若操作实验室温度较低,建议置于25 oC烘箱,可以使风干更短时间内完成。

③在20oC到25oC,用预冷的100%丙酮固定细胞约10分钟。注意:丙酮是易挥发、可燃性物质,使用时请远离明火。丙酮可重复使用,可用 ④从丙酮中取出载玻片并风干。

⑤在固定并风干的细胞上滴加对应的七种DFA染色试剂,使其完全覆盖细胞。 ⑥在呼吸道病毒抗原对照板的每孔内也要滴加七种DFA染色试剂。抗原对照板包含了被病毒感染的细胞和未感染的细胞,只能一次性使用。

⑦在阴性对照孔内滴加正常鼠丙种球蛋白试剂,使其完全覆盖细胞。(此步骤仅限筛查试剂)备注:以上步骤①~⑦建议在二级生物安全柜中完成。

⑧将载玻片放于35oC到37oC的恒温箱内孵育15分钟,为保持其湿润最好放置于带盖的盒子内。(可置于培养皿内,或用盖子将玻片盖住均可)

⑨用事先稀释好1倍的洗液(试剂盒内40×洗液稀释)漂洗染色细胞。为了更有效地洗涤,请将玻片在洗液中反复浸蘸4次左右。(洗液颜色变深即可更换,一般洗10块板左右)

⑩使用新的1倍洗液再洗一次。请用少量的洗液冲洗玻片。 ?用去离子水再洗一遍。

4、观察实验结果与判断

滴加1到2滴固定液,以盖盖玻片时不产生气泡为益。并加盖盖玻片(20X50 mm),要注意避免产生气泡。在200倍放大荧光显微镜下观察结果。

试剂盒中染色液包含FITC荧光物标记的特异性抗体,阳性的样本会结合特异性抗体,结果观察需要在荧光显微镜下观察。 荧光需要蓝光激发,荧光激发波长约480nm左右。FITC在蓝光激发下发绿色荧光,反射光波长为520nm左右。因此,阳性感染细胞应发绿色荧光。

阳性结果判断:在样本孔中低倍视野下若有2个或以上由细胞发出果绿色荧光,即为该孔所对应的病毒阳性。

实验后,已使用的鼻咽拭子、储存管、玻片等按照国家有关医疗废弃物处理规定进行处理,无需特别处理措施。可重复使用的试剂(丙酮、试剂盒自带的漂洗液等)在达到使用次数限制以后按照规定进行处理。


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