绪论 课程基本情况 培养基的构成（维持离体细胞生存和生长的溶液）：
植物组织培养：植物的离体器官、组织或细胞在人工制备的培养基上进行无菌培养并1、水、无机盐、PH：包括大量元素（N，P，K，Ca、S、Mg），微量元素（Fe、Mn、使其发育成完整植株的科学技术。简称组培。也称离体培养或试管培养。 Zn、B、Mo、Cu、Cl、Co、I）。 理论依据——植物细胞全能性：任何有完整细胞核的植物细胞，具有全部的遗传信息，2、有机化合物： 在一定条件下均具有发育成一个完整植株的潜在能力。动植物细胞分化差异。 ①有机碳源：即糖类。（作用：维持渗透压；提供碳源和能量；防止幼胚早熟；影响植物细胞全能性必须满足的条件： 组织分化类型（高浓度分化出韧皮部，低浓度仅长出木质部，浓度适中二者兼有））。 1、要使这些细胞处于离体条件下，解除植物体其余部分对这些细胞的抑制性影响； ②维生素类：（作用：直接参与生物催化剂（酶）的形成、蛋白质、脂肪代谢等重要2、要给予它们适当的刺激，就是给予它们一定的营养物质和激素的作用。 生命活动。） 植物组织培养过程（无菌环境操作）： ③有机含氮化合物 外植体→（脱分化）→愈伤组织→（再分化）→试管苗→→植株 3、植物生长调节物质：生长素，细胞分裂素，赤霉素，脱落酸等。 外植体（离体器官）：由活植物体上切取下来的可以用于组织培养的组织或器官（包生长素的主要作用：诱导外植体脱分化产生愈伤组织；促进培养物生长；诱导根器官括胚、芽茎尖、叶、花瓣等）。 的分化。 初代培养：指外植体的最初培养。 细胞分裂素主要作用：促进细胞的分裂和分化；诱导不定芽和胚状体的分化和形成；继代培养：将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中进行再培养，称为继代培养 延缓组织衰老；增加蛋白质合成。
脱分化：由高度分化的植物器官、组织或细胞经过离体培养，产生无结构的愈伤组织4、附加物类、凝固剂：琼脂（做支持物），琼脂糖（改善通气状况），PVP、Vc、硝或细胞团的过程。 酸银、活性炭（防褐化）、椰乳，马铃薯萃取液等。 再分化：脱分化产生的愈伤组织在培养过程中重新分化出根或芽等器官的过程。 培养基的基本类型及特点： 组织培养类型： 1、含盐量较高的培养基，特点是：无机盐浓度高，特别是硝酸盐、钾离子和铵离子根据所培养的植物材料的不同：组织培养；细胞培养；器官培养；胚胎培养；原生质含量丰富。元素平衡较好，缓冲性能好。微量元素和有机成分含量齐全且较丰富，目体培养 前应用最广。如MS培养基。
愈伤组织：原来是指植物在受伤之后，在伤口表面形成的一团薄壁细胞。在组织培养2、硝酸钾含量较高的培养基，特点是：培养基盐类含量较高，铵态氮含量较低，但中，它是指在培养基上由培养物产生的无序的薄壁细胞团。 盐酸硫胺素和硝酸钾含量较高。如B5、N6、SH培养基。 愈伤组织培养：将一个细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过去分化形成愈伤组织，3、中等无机盐含量的培养基，特点是：大量元素含量约为MS培养基的一半，微量并在体外培养使之再分化成植株的技术。（最常用） 元素种类少但含量较高，维生素种类较多。如Nitsch培养基、H培养基。
悬浮细胞培养：不断搅动或摇动的液体培养基中培养单细胞或小细胞团的培养方式。4、低无机盐含量的培养基，特点是：无机盐含量非常低，为MS培养基的1/4左右，（主要目的生产有用产物）。 有机成分也很低。如White（怀特）培养基、WS培养基、HE培养基。 器官培养：对植物的根、茎、叶片、花器等各个器官进行离体培养。（用于苗木快速培养基的划分： 繁殖）。 （一）常用的培养基：MS培养基；B5培养基；White培养基。 茎尖分生组织培养：使用茎尖无病毒分生组织为材料进行培养。（脱毒培养）。 （二）按试验目的分为：诱导培养基，继代培养基，分化培养基，生根培养基。 原生质体培养：去除细胞壁、裸露的原生质体的培养。（创建种间或属间新品种）。 （三）按物理性质分为：固体培养；液体培养； 根据培养过程：初代培养；继代培养；生根培养： 液体培养又分为静止培养和振荡培养（培养物在培养过程中可均匀接触吸收培养基成根据培养基的物理状态（培养条件）：固体培养；液体培养；半固体培养；双层培养： 分；可以保持良好的通气条件） 器官再分化两种方式：器官发生型；胚胎发生型 培养基的筛选：筛选；调整。 器官发生型：由愈伤组织不同部位产生不定芽或不定根，通常是单极性。 培养基的制备：母液的配制；培养基配制 胚胎发生型：由愈伤组织产生胚状体或称体细胞胚，胚状体是双极性，芽根之间有维配制母液注意几点：（低倍数、冷藏、现配） 管束连接，可独立生长成完整植物体。 1、配制倍数不宜过高，可避免浪费；也可避免倍数过高，吸取量相对少而影响准确组培模式：培养基模式（MS, White, B5, N6）；激素调控模式（CTK/IAA）。 性。2、母液配制好后应放在2～4℃冰箱内保存。 3、母液贮备时间不宜过长。过组培优点：①培养条件可以人为控制；②生长周期短，繁殖率高；③管理方便，利于长时宜出现沉淀和微生物污染。 工厂化生产和自动化控制 建立离体培养体系的基本程序：无菌外植体的获得；初代培养物的建立；形态发生和组培的应用及前景： 植株再生 (1)理论研究方面的应用：研究细胞分化和器官建成响应因素的主要方法。 外植体选择的基本原则：再生能力强；遗传稳定性好；来源丰富；易灭菌；大小适宜。 (2)快速繁殖：离体诱导不定芽分化和促进腋芽增殖。 培养材料的灭菌要求：①消灭病菌 ②减少对材料的损伤 (3)脱毒培养：离体茎尖培养技术可脱除病毒，解决无性繁殖植物品种退化 材料灭菌过程：材料前处理、消毒液处理（程序: 75%酒精30s，0.1%升汞消毒5～(4)人工种子制备：通过诱导体细胞胚（胚胎发生） 30min）、无菌水冲洗。 (5)次生产物的生产：有用化合物的工业化生产。 污染主要类型及特征： (6)植物种质资源的保存和交换； 1、细菌：菌斑粘液状。在材料基部挨着培养基的部位，一般短时间内可以观察到。(7)遗传操作上的应用： 1-3天。
①突变体的筛选：用诱变因子（射线或化学物质）诱变愈伤或悬浮细胞，可提高诱变2、真菌：有颜色的霉菌。时间较长才能看到。10-30天之后出现。 率，可筛选出一些优良品种。 污染的控制措施：（内外两方面考虑） ②离体授粉及胚胎培养：克服远缘杂交的不亲和性（受精前、后的障碍）。 1、操作环节：①改善环境条件;②严格执行无菌操作;③严查接种材料;④经常检查灭③原生质体融合：可获得有性杂交不能产生的杂种；产生细胞质杂种。 菌设备的质量;⑤检查培养容器是否存在问题。 ④单倍体的诱导：花药培养技术可缩短杂合体纯合时间，加速育种进程。 2、内源细菌：①培养基中加入杀菌剂;②反复茎尖培养;③降低PH值 ⑤遗传转化：基因工程不可缺少的部分。 第二章 植物离体繁殖 组培发展阶段：开创；奠基；建立时期。 植物离体繁殖：利用组织培养技术对外植体进行离体培养，短期内获得遗传性一致的
第一章 实验室与基本操作 大量再生植株。也叫快繁或微繁。
组培实验室组成：洗涤室（准备室）；配置室；灭菌室；接种室；培养室；观察室等。 快繁突出特点：1、繁殖效率高;2、培养条件可控性强;3、便于管理、占地面积小;4、//准备室；无菌操作室；培养室；细胞学实验室；温室。 //准备室；无菌操作室；培利于种质资源的保存及交换。 养室；温室。 快繁的应用： 灭菌装置：①高压蒸气灭菌装置；②细菌过滤器 1）短期内获得大量形状优良、整齐一致的种苗群体。加快引进新种、新育良种的繁超净工作台工作原理:利用鼓风机驱动空气通过高效过滤器除去空气中的尘埃颗粒，殖，促进优良品种推广和应用。 使空气得到净化。净化空气缓缓通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 2）大量繁育原来常规方法不能进行无性繁殖、难繁殖和繁殖速度慢的一些植物，尤实验基本设备：①器皿和器械（玻璃器皿；器械类）；②仪器设备 其对一些珍、稀、濒危的植物的繁殖有更重要的意义。 基本操作：洗涤；灭菌；无菌操作。 3）作为培育新品种的有效手段，繁殖和保存育种材料。 洗涤方法：重铬酸钾洗液洗涤；洗涤剂洗涤；超声波洗净器洗涤（要加水）。 4）通过茎尖培养等技术脱毒，扩增脱毒苗，达到提纯复壮良种的目的。 灭菌方法及适用范围： 快繁的器官形成方式 1、干热灭菌：鼓风干燥箱（烘箱），150℃，120min。玻璃器皿. 1、短枝发生型；特点：一次成苗，过程简单，易成活，遗传性状稳定。 2、湿热灭菌：高压蒸汽灭菌，121℃，0.1MPa， 15～20min。培养基灭菌. 2、器官型（丛生芽发生型）；特点：由单芽到丛芽，繁殖速度快，遗传性状稳定。 3、熏蒸灭菌：药物熏蒸。培养室、接种室灭菌. 3、器官发生型（不定芽发生型）；特点：繁殖速度快，由愈伤组织再生植株，遗传不4、过滤灭菌：使溶液通过夹有微孔滤膜的漏斗，然后在无菌环境下，用真空泵抽滤，稳定。 其滤液为无菌。液体培养（不耐高温活性物质） 4、胚胎发生型；特点：发生数量大，速度快，结构完整。
5、药剂灭菌：70～75%酒精、0.1～0.2%升汞、10%的次氯酸钠等药剂灭菌。培养材5、原球茎发生型；茎尖或腋芽外植体通过形成原球茎，而发育为完整植株，应用于料灭菌。 兰花。 6、烧灼灭菌：酒精灯烧灼灭菌。接种器具灭菌。 快繁程序：无菌母株的制备，继代芽的增殖，芽苗生根培养 ，再生植株的锻炼和移7、射线灭菌：紫外线照射灭菌，照射时间一般为15～30min，接种时应关闭紫外灯。栽。 室内灭菌。 1、无菌母株的制备
初代培养：选取遗传性状优良、稳定，生长健壮、无病虫害植株上的外植体，经适当（缺点）在使用该法分离细胞时，必须对酶溶液给予渗透压保护，以防止细胞的胀裂。 有效灭菌处理后，接种在培养基上，诱导其产生芽（腑芽或不定芽）和愈伤组织。 3.由愈伤组织中分离单细胞
初代培养的启动生长方式:腋芽被刺激后生长；茎段、叶片、其它器官伤口处产生不通过固体培养诱导外植体脱分化,把未分化和疏散的愈伤组织转移到装有液体培养基定芽；外植体切口产生愈伤组织。 的三角瓶内，将这些悬浮培养物在摇床上进行振荡培养，并得到游离细胞。 2、继代芽的增殖 振荡的作用： 无菌母株再次切割继代培养，芽分化增殖成丛芽，加快繁殖速度。 （1） 对细胞团施加一定的缓和压力，使之破碎成小细胞团或单细胞。 在快速繁殖过程中，随培养时间和继代次数增加，芽分化和生长速率降低，称为驯化（2） 振荡可使细胞或细胞团在培养基中均匀分布。
现象，与内源激素和恒定培养条件有关，故可以调节激素配比或变温处理，提高繁殖（3） 促进培养基和容器内气体交换，保证细胞正常的呼吸代谢。 速度。 单细胞的培养方法 3、芽苗生根培养 1、平板培养法：是将悬浮培养的细胞接种到薄层培养基上进行培养的过程，是常用诱导无根苗生根的方法有两种：试管内生根和试管外生根。 的单细胞培养法。 1）试管内生根：将无菌小枝条转入生根培养基中进行培养。 2、看护培养法：用同种或异种材料的愈伤组织作为看护组织来培养细胞的一种方法。 提高生根率的措施：①降低无机盐和有机物含量；②适当提高生长素的浓度，降低细3、微室培养：将单个细胞放到人工制造的一个小室中进行培养的一种方法。 胞分裂素的浓度。；③降低渗透压；④暗培养。 优点：在培养过程中可以连续进行显微观察，把一个细胞的生长、分裂和形成细胞团2）试管外生根：有些植物可以在离体条件下形成的枝条，在基部切口处用生根粉或的全部过程记录。 与滑石粉混合的IBA涂抹，然后种植到温室或田间中，这样的方法可大大降低成本。 4、条件培养基培养法：在培养基中加入高密度的细胞进行培养，经过一定时间后, 这4、再生植株的锻炼和移栽（移栽过程要注意的一些问题） 些细胞向培养基中分泌一些促进细胞生长的活性物质，使培养基条件化。使原来在合1）将小苗根系周围的培养基冲洗干净，以避免有害微生物的污染。 成培养基上不能分裂的细胞发生分裂。
2）筛选适宜的移栽基质； 3）选择使用营养钵、苗床或塑料薄膜以及遮阳网，以调细胞的悬浮培养：指将游离的植物单细胞或小细胞团,按一定的细胞密度,在受到不断控光、温、湿度等。 4）注意移栽前后培养条件的改变。 搅动或摇动的液体培养基中进行培养的一种方式。 移栽后植株死亡的原因: 悬浮培养特点： 1）根系结构不完善：不生根（木本植物）、根与芽的输导组织不相通（愈伤组织）、1）细胞可不断增殖，且细胞增殖的速度比愈伤组织快，可形成高密度的细胞群体，再生根的吸收功能差。 适于大规模培养；
2）叶部结构不完善：缺少角质层或蜡质层，保水性差；缺乏叶表皮毛，保湿、反光2）能提供大量比较均匀一致的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。 性差；气孔开度过大，关闭能力差；叶片中栅栏组织发育不完善，光合能力低。 悬浮培养一般采用愈伤组织作为起始细胞来源： 克服这些因素的方法： 用于建立悬浮体系的愈伤组织至少应该具备的条件： 培育壮苗：培养基中加入适宜的生长延缓剂（多效唑、矮壮素、B9等）。 1、要有较好的松散性，使之在悬浮培养的起始阶段容易打散； 炼苗：1）日光锻炼； 2）湿度锻炼；3）温度锻炼；4）闭瓶炼苗与开瓶炼苗相结合。 2、要具备较强的增殖和再生能力； 快繁中的问题： 3、组成愈伤组织的细胞要有较高的均匀一致性。 一、污染；（原因：培养基及器具灭菌不彻底，操作的人为带入，环境不清洁） 为了获得符合条件的良好愈伤组织: 二、遗传稳定性；（控制：减少培养基中容易诱导变异的物质、定期清除不正常的组1、必须选择适宜的外植体材料。 培苗） 2、培养基的附加成分对疏散型愈伤组织的诱导具有较大的影响，其中生长素的浓度三、玻璃化：是指由于试管苗发生生理失调，而形成的发育不正常的组培苗。常常表最为重要。 现为叶片皱缩、易碎、嫩叶呈水浸透明状。移栽后常死亡。 3、愈伤组织培养阶段必须进行必要的选择和继代。 原因：培养基中琼脂与蔗糖的浓度低、细胞分裂素与生长素比例失调、培养基中含氮一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足3个基本条件： 量高、培养温度高、光照不足 1. 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下。 防止措施: 2. 均一性好，细胞形状、细胞团大小及其生理状态大致相同，悬浮系外观为大小均1、加入琼脂提高培养基硬度；2、提高蔗糖含量，降低培养基的渗透压； 一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。 3、减少含氮成分、降低温度或变温处理、提高光照； 3. 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加1倍。 4、添加抗玻璃化的化学物质：活性炭、聚乙烯醇、多效唑、青霉素等。 悬浮培养的方法
四、褐化：是指培养材料向培养基中释放褐色物质，使培养基和培养材料逐渐变褐而1、分批培养：指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，建立单细胞培养物的死亡的现象。 培养方式。
本质：酚类物质在多酚氧化酶的作用下，氧化形成褐色的醌类物质，导致植株中蛋白细胞数目的变化曲线：大致呈“S”型曲线。 质变性、酶失活。 ①延滞期：细胞很少分裂，细胞数目增加少。 影响因素： ②对数生长期：细胞分裂活跃，数目迅速增加。 1、植物的品种与种类；2、外植体的生长发育时期、外植体的切口； ③直线生长期：细胞增殖最快时期，单位时间内细胞数目增长大致恒定, 细胞数目达3、培养温度、培养时间；4、培养基中成分：无机盐高、细胞分裂素高。 到最高峰。 褐化的防止措施： ④缓慢期：培养基中某些营养物耗尽，或是有毒代谢物的积累，增长速度逐渐变慢。 1、外植体的选择； 2、培养基中激素的调整； ⑤静止期：生长趋于完全停止。 3、培养基中添加抗氧化剂等。抗坏血酸、柠檬酸、活性炭等、 分批培养的优点：培养装置和操作简单，应用方便。 4、培养温度降低、光照减少； 5、缩短继代培养时间。 2.半连续培养:利用培养罐进行大量细胞培养的一种方式。 五、黄化：是指试管苗整株失绿、叶片全部或部分发生黄化现象。 该培养方法能重复地获得大量均匀一致的培养细胞。 原因： 3.连续培养：利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式。 1、培养基成分：含铁量少、或矿质营养不平衡、激素配比失衡、糖分不足；2、培养特点： 条件：通气差、光温及酸碱度不适、抗生素的使用。 ⑴不断注入新鲜培养基，排掉旧的培养基，可以保证养分的充足供应，不会出现悬浮控制：调节培养基成分，调节温度 培养物发生营养亏缺的现象。
第三章 植物细胞培养 ⑵可在培养期间使细胞长时间保持在对数生长期。
植物细胞培养：指对从植物器官或由愈伤组织上分离的单细胞（或小细胞团）进行培⑶适于大规模工厂化生产。 养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。 连续培养可分为：封闭型和开放型 细胞培养的意义 1）封闭型连续培养 1、有利于进行细胞生理代谢以及各种不同物质对细胞代谢影响的研究。 在培养过程中，排出的旧培养基由加入的新鲜培养基进行补充，进出数量保持平2、进行细胞培养，通过单细胞的克隆化，即称为“细胞株”，可以把微生物遗传技术衡，排出液中的细胞经机械收集后又放回到培养系统中；培养容积不变，随培养时间用于高等植物以进行农作物的改良。 延长，细胞不断增殖，细胞密度不断增加。旧培养液用虹吸法排出。 3、细胞培养的增殖速度快，适合大规模悬浮培养，生产一些特有产物。 2）开放型连续培养 4、由单细胞培养获得的单细胞无性繁殖系，并对不同的细胞进行研究，在理论上和在培养过程中，注入的新鲜培养液的容积与流出的细胞培养物溶液容积相等，实践上都有很重要的意义。 同时要求细胞密度保持恒定，即细胞增殖速度的稳定。
细胞培养：从高等植物的某个特定的器官或组织中取得单个细胞进行培养，并诱导其细胞密度保持恒定的两种控制方法：① 化学恒定式;②浊度恒定式(比浊计或分光光分裂增殖，由细胞分裂形成细胞团，再通过细胞分化形成芽根等器官或胚状体，长成度计来测定培养液中细胞的混浊度) 完整植株。 细胞的同步化:指培养基中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段。 单细胞的分离方法及优缺点 实现悬浮培养细胞同步化的主要方法：1.饥饿法；2.抑制法；3.分选法；4.低温处理。 1.机械法（刀片刮；研磨离心法） 悬浮培养中细胞生长的测定：细胞计数；细胞密实体积（PCV）及细胞总体积；细胞（优点）⑴细胞不受酶的伤害；⑵不发生质壁分离； 鲜重和干重；细胞有丝分裂的指数 （缺点）（3）材料要求是薄壁细胞、组织排列松散；（4）产量低。 培养细胞活力的测定：1.四唑盐还原法（TTC法）;2.荧光素二乙酸法（FDA法）;3.2. 酶解法 伊凡蓝染色法。 （优点）能得到比较均匀一致的海绵组织细胞或栅栏组织细胞； 细胞活力：未染色的活细胞数占总观察细胞数的百分数。
细胞培养的应用 2、酶解法
1、天然化合物的生产与转化：(1)植物次生代谢产物的生产；(2)进行特定的生物转化优点：可以获得大量的原生质体，适用于几乎所有植物和器官，双子叶植物叶肉细胞反应；(3)细胞的工厂化生产。 比单子叶更易分离。 2、突变体选择：(1)直接选择法；(2)间接选择法（负选法）。 缺点：酶制剂含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶及酚类物质，会影响原生质体的活力。 3、诱导多倍体 影响原生质体数量与活力的因素 工厂化生产途径的3个步骤：1.高产细胞株的选择；2.“种子”培养；3.细胞的大规模1）光；一般在黑暗静止条件下进行. 培养 2）温度；酶解温度25-30℃,兼顾原生质稳定性及酶活性.
生物转化：利用生物系统水解、加氢、羧化、脂化、氧化还原一系列生理生化反应，3）时间；几小时到几十小时,太长影响原生质活力,一般小于24小时,如烟草叶片保温将有机物产物分子转化为新的化合物或提高该物质的产量的过程。 24小时叶肉细胞解离完毕.
人工种子：指在胚状体外面包裹一些有机化合物，作为保护胚状体及提供营养的“种4）细胞壁降解酶的种类和组合；一般植物细胞使用纤维素酶和果胶酶，花粉细胞和皮”，形成与真种子类似的结构。包括体细胞胚、人工胚乳和人工种皮三部分。 四分体小孢子可使用蜗牛酶和胼胝质酶。 人工种皮：最外一层有机薄膜，保护水分免于丧失和防止外部的物理力量的冲击； 5）渗透压的稳定剂种类；甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等，如甘露醇一般为0.5-0.7M。 人工胚乳：中间的包埋材料，含有胚状体所需要的营养成分和某些植物生长调节剂； 6）原生质膜稳定剂；(CaCl2：0.1mM,葡聚糖硫酸钾 0.2-0.3%；葡聚糖硫酸钾体细胞胚：最里面的胚状体或芽。 0.2%-0.3%。 广义：任何一种经人工种皮包裹或裸露的具有形成完整植株能力的繁殖体均可称为人7）pH影响；5.4-6.0。 工种子。 原生质体的纯化（净化）：指将酶解后的溶液中的原生质体与组织残渣（如去未脱壁分类（四类）： 的细胞、细胞碎片）分开的过程。 ①裸露或休眠繁殖体，不加外层包裹成株率也比较高，可直接种植。 (1) 沉降法（一般叶肉原生质体均采用此法） ②由一层聚氧乙烯“种皮”包裹，胚吸收水分后，能够发芽。 优点：采集方便；缺点：不能完全除去少量的细胞和破碎的原生质体。 ③水凝胶包裹的胚状体、不定芽等繁殖体，常常加入多种养分或激素而促进发芽。 (2) 悬浮法（漂浮法） ④液胶包埋，将含水的繁殖体由液胶包埋起来。 优点：可收集较纯的原生质体，原生质大小较一致；缺点：获得原生质数量少，而且人工种子的优点： 高渗溶液对原生质体有害，收集较沉降法困难。 ①使自然条件下不易结实或种子昂贵的某些材料能快速繁殖和保存； (3) 界面法 ②繁殖速度快； 优点：可收集到较大的纯净的原生质体，同时避免收集过程中原生质体的破损。 ③为基因工程技术应用于生产提供桥梁； 原生质体的培养方法： ④在人工种子种皮制作中，可加入各种营养成分或生长调节剂，调节植物生长，提高1、固体培养法（平板法）： 植物抗逆性； 2、液体培养法：（分为浅层液体培养和悬滴法） ⑤固定杂种优势，使F1代杂种多代利用； 3、双层培养法：将原生质体悬浮液，倒入已凝固的琼脂培养基上进行培养。液体培⑥便于运输与贮藏(相对于试管苗)。 养与固体培养相结合，保持湿度较好， 人工种子的制备程序：体细胞胚（或其它繁殖体）的生产；成熟与干燥；人工种子的4、琼脂糖珠培养 包埋等。 植株再生过程：细胞壁再生；细胞分裂；植株再生。 繁殖体是人工种子的主体。 原生质体培养的影响因素：①原生质体活力；②培养的起始密度；③培养基；④培养体细胞胚标准：要有较高的同步化程度和活力，且可规模化生产；形态正常，具有完条件：a 光照、b 温度、c 湿度。 整的胚结构；与母体植物的基因型基本相同，特别是在重要经济性状上无变异（遗传体细胞杂交（原生质体融合）：通过物理或化学的方法使原生质体融合，通过培养获稳定性好）；具有较好的成熟性，能耐受一定程度的脱水。 得具有双亲遗传物质的后代。 成熟培养基特点:① 在培养基中减少或除去激素；② 加入ABA及提高蔗糖浓度；③ 体细胞杂交的重要性（意义）：1、实现远缘遗传重组，创造新遗传种质；2、实现核加入PEG。 质互作的遗传性状组合； 人工种子的包埋包括人工胚乳和人工种皮的包裹。 植物体细胞杂交的主要程序：原生质体的制备；原生质体融合；杂种细胞的选择；杂包埋介质要求： 种细胞的培养；杂种植株的鉴定
1、保护及安全性：既要能对繁殖体起保护作用，又要对繁殖体没有毒害，同时还要原生质体融合方式类型：对称融合、不对称融合、微原生质体融合。 具有一定的缓冲强度，以保证繁殖体在生产、运输和种植操作中的安全性。 原生质体融合方式：自发融合；诱导融合。
2、营养作用：包埋介质中最好能够混合一定的营养成分，提供类似于胚乳的营养物诱导融合方法：化学方法（PEG融合法，高钙---高PH融合法）；物理方法（电融合质以供繁殖体发芽的需要。 法、超声波法）
3、抗菌抗病作用：由于繁殖体的含水量较高，贮存中极易受到微生物的感染危害，PEG诱导融合特点：优点：融合成本低，无需特殊设备；融合子产生的异核率较高；因此，介质中还应含有适当的杀菌剂等。 融合过程不受物种限制；缺点：融合过程繁琐，PEG可能对细胞产生毒害。 常见的人工种子的包裹方法有：1. 离子交换法；2. 干燥法；3. 冷却法 电融合有三大优点：一是不存在对细胞的毒害作用；二是融合效率高；三是融合技术人工种子制备技术：1、胚状体的诱导；2、成熟与干燥；3、人工种子的包埋 操作简便。 理想的人工种皮要求： 膜融合的反应分成：接触，诱导，融合，和稳定四个时期 ①应该具有一定的封闭性，以保证人工胚乳的各种成分不易流失； 融合体发育过程：细胞壁再生；核融合；细胞增殖。 ②应该具有良好的透气性，以保证繁殖体维持生理活性的需要； 杂种细胞的选择方法： ③要有一定的坚硬度，以加强人工种子的贮藏性能和适于机械化操作； 1、互补筛选法：a.激素自养型互补选择；b.白化互补选择；c.营养缺陷型互补选择；④无毒无害，能保证繁殖体顺利穿透发芽； d.抗性突变体互补选择；e.基因互补选择。 ⑤配制简单易行，成本低廉等。 2、机械筛选法：a.天然颜色标记分离；b.荧光素标记分离；c.荧光活性自动细胞分类常用人工种皮：Elvax4260；二氧化硅化合物（操作简单易行，效果较好）；硅酮种衣。 器分类融合体。
第四章 原生质体培养与细胞融合 杂种植株的鉴定：1、杂种植株和亲本植株的形态学特征（形态学鉴定）；2、杂种和
植物的原生质体：指除去细胞壁以后的裸露细胞。 亲本的核型分析（细胞学鉴定）；3、同工酶谱分析（生物化学鉴定）；4、分子生物学原生质体培养：是将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，使其再生细胞方法（分子生物学鉴定）。 壁，进而细胞进行持续分裂形成细胞团，进一步生长形成愈伤组织或胚状体，最后分
第五章 植物的胚胎培养及离体授粉 化或发育形成完整植株的过程。
原生质体培养特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质；②便于进行细胞融合，形成植物胚胎培养:指胚和胚器官（子房、胚珠）在离体条件下培养发育成完整植株的技杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。 术。
植物胚胎培养包括：胚培养、胚珠培养、胚乳培养、子房培养、试管受精（离体授粉） 原生质培养首先在烟草上获得成功。
胚乳培养：指处于细胞期胚乳的离体培养,使之分化发育为完整植株。 原生质体培养的意义
①比较容易摄取外来的遗传物质——研究植物原生质体培养和再生植株技术，有可能胚珠培养：将授粉的子房在无菌的条件下解剖后，取出胚珠置于培养基上培养形成幼
苗的技术 采用细胞遗传工程的方法培育出新品种。
②便于进行细胞融合，形成杂交细胞——可广泛地重组植物界优良遗传性状，创造新子房培养：指将子房从母体上分离下来，放在人工配制的培养基上，使其进一步生长
发育成为幼苗的过程。 物种和新品种
植物离体授粉：指将未授粉的胚珠、子房或柱头从母体上分离下来，进行无菌培养，③原生质体可作为遗传理论研究的材料。
并通过一定的方式授给无菌花粉，使其在试管内实现受精的技术，又称为试管受精或原生质体培养程序中预处理：可提高原生质体产量和代谢活力。
离体受精。 叶肉组织是制备原生质理想的材料，遗传性状一致。
在高等植物种间或属间远缘杂交时的问题: 分离原生质体的方法：
①受精前障碍:由于不亲和性，常常还会发生花粉不能在异种植物柱头上萌发或花粉1、机械法
管生长受到抑制不能进入子房。——离体授粉受精 （优点）可避免酶制剂对原生质体的某些破坏作用。
（缺点）获得的原生质体少；产生的原生质体的细胞类型受到限制，一般取材局限于②受精后障碍:即使受精，由于胚和胚乳之间的不亲和性，造成胚乳发育不良，或杂
种不能发育成熟，使胚在早期败育。——胚培养，有可能获得杂种植株。 具有液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织。
胚培养类型：成熟胚培养、幼胚培养。 花药培养产生的花粉植株一般有两条途径： 幼胚离体培养中的生长方式（三种）： 1）花药中的花粉通过胚状体阶段发育为小植株，例如烟草、曼佗罗等。 1、胚性发育：继续进行正常的胚胎发育，维持胚性生长，形成成熟胚（类似种子）2）花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再诱导分化植株。 再按种子萌发途径出苗形成完整植株（一个胚只形成一个植株）。 花粉培养特点:可以避免花药壁、药隔及花丝等体细胞愈伤组织的干扰，可以获得大2、早熟萌发：是在培养后迅速萌发为幼苗，不继续进行胚性生长，越过正常胚发育量的花粉植株，相当于单细胞培养。 阶段，在未达到生理和形成成熟胚的情况下，萌发长成幼苗。（早熟萌发形成的幼苗花粉的分离方法：自然散落法、挤压法、机械游离法。 往往畸形瘦弱，甚至引起死亡。） 花粉培养的方式：平板培养；看护培养；微室培养；液体浅层培养；双层培养。 3、形成愈伤组织：多数情况下，幼胚在离体培养中首先细胞分裂形成愈伤组织，再单倍体植株的应用： 分化形成植株。（为胚性愈伤组织，易形成植株） 1．单倍体育种：单倍体植株的染色体加倍，可形成纯合的二倍体，恢复植物育性，胚胎发育过程分为两个时期： 缩短新品种的选育周期；由于以花药培养可得到大量的倍体植株，因此成为单倍体育① 异养期：即在胚发育早期，幼胚由胚乳及周围的组织提供养分。 种的有利工具，用花药培养进行单倍体育种的优点是缩短育种年限，加速F1代杂合② 自养期：胚在代谢上已经能在基本的无机盐和蔗糖的合成培养基上生长，在营养体的纯化。 上已相当独立。 2．对于二倍体植物加倍变成四倍体或倍数更高的多倍体，可以改善原来植物的某些幼胚培养不同时期对培养基要求不一样，异养期培养基成分复杂，自养期则相对简单。 经济性状。 1、固体培养（双组分培养基培养）；2、胚乳看护培养 3．对异花授粉作物（如玉米）的单倍体植株进行加倍，可迅速获得自交系，免去了胚胎培养的应用：1．克服远缘杂交不亲和性；2．打破种子休眠；3．缩短育种周期 ；烦琐的人工自交过程，节省大量的时间和人力。 4．克服种子的自然不育性 4．排除显隐性基因干扰，有利于进行突变体选择。 影响胚培养的因素：培养基（无机盐、碳水化合物、其它成分），环境条件（温度和第七章 植物组织的脱毒培养 光照），胚柄三个方面 病毒:一类结构简单生物，由核酸和蛋白质分子组成。病毒结构简单，没有完整的酶糖在胚培养中具有三个方面的作用：①调节培养基的渗透压；②作为碳源和能源；③系统来独立地进行物质代谢和能量代谢，只能依靠寄主生物的酶系统实现生理代谢过防止幼胚的早熟萌发。 程，因此，具有寄生性。
诱导愈伤组织时，加生长素、细胞分裂素；胚胎发育时，不加生长素、细胞分裂素；病毒危害：1）导致植物产量和品质的大幅度降低；2）通过无性繁殖或者种子传给下GA3、KT促进早熟萌发；ABA抑制早熟萌发 一代。
裸子植物中胚乳是由雌配子体发育而成的，是单倍体；被子植物中胚乳一般是双受精通过植物组织培养方法，可脱除植物病毒，恢复种性，使品种复壮，提高产量品质。 的产物，是由两个极核和一个雄配子融合而成的三倍体。 茎尖培养脱毒的理论依据：病毒在植物组织中分布不均匀，在顶端分生组织中含毒少，胚乳培养方法：1、胚乳外植体的制备；2、胚乳愈伤组织再生植株：a.愈伤组织的诱在老组织中病毒增加。 导;b.器官发生途径(器官发生型和胚胎发生型均有) 茎尖分生组织无病毒原理（原因）： 三倍体后代的特征： (1)能量竞争：病毒核酸和植物细胞分裂时DNA合成均需要消耗大量的能量，而分生1、形态特征：粗壮，叶片大而肥厚，叶色浓，花型大或重瓣，果实大但结实率低。 组织细胞本身很活跃，其DNA合成是自我提供能量自我复制，而病毒核酸的合成要2、胚乳再生植株的倍性：在胚乳培养中常常发生染色体倍性的混乱现象，即多数胚靠植物提供能量来自我复制，因而就得不到足够的能量，从而就抑制了病毒核酸的复乳培养具有多种数目的染色体细胞组成。 制。
影响胚乳细胞在培养中染色体稳定性的因素主要有：胚乳的类型；胚乳愈伤组织发生(2)传导抑制：病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在茎尖分生组织的部位（合点端还是珠孔端）；培养基中外源激素的种类和水平。 中，维管组织还不健全或不存在，从而抑制了病毒向分生组织的传导。
影响胚乳培养的因素：1、培养基与培养条件；2、胚乳的发育程度；3、胚在胚乳培(3)激素抑制：在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平均很高，因而阻滞了病毒的养中的作用 侵入或者抑制病毒的合成。 胚乳发育时期可分为早期、旺盛生长期和成熟期 (4)酶缺乏：病毒的合成需要的酶系统在分生组织中缺乏或还没建立，因而病毒无法胚乳培养类型：带胚培养、不带胚培养。 在分生组织中复制。 胚乳培养的应用： (5)抑制因子：在分生组织中存在有某种抑制因子，如 “酶钝化系统” 。
1）三倍体幼苗和植株的获得：对于以种子生产为目的的植物是无益的，但有时无籽脱除植物病毒的方法：1、茎尖培养脱毒；2、热处理脱毒；3、愈伤组织脱毒；4、微果实及以营养体生产为目的的植物则具有重要经济价值。 体嫁接脱毒5、珠心胚培养脱毒； 2）胚乳植株染色体的不稳定性，为染色体工程的研究提供有效的途径。 在茎尖培养中影响脱毒的因素：1）培养基；2）外植体的大小；3）培养条件（光照、3）为研究淀粉、蛋白质和脂肪等产物的生物合成及其代谢，提供了良好的实验系统。 温度）；4）外植体的生理状态：（顶芽茎尖比腋芽茎尖效果好；生长期的材料比休眠胚珠培养分类：受精胚珠的培养；未受精胚珠的培养 期好） 胚珠培养的意义： 热处理与茎尖培养结合，即可取较大的茎尖培养，大大提高茎尖成活率和增殖率，又1．利用胚珠培养技术，对杂种在胚珠时期开始培养，可获得杂种植株，防止杂种胚达到消除病毒的目的。 早期败育。 热处理脱毒的原理：（利用病毒和寄主植物对高温的耐热性的差异） 2．用未受精的胚珠培养以及未受精的胎座或子房培养可以作为试管受精的技术基础。 ⑴某些病毒受热后不稳定，高温使这些病毒失去活性，可以部分地或完全地被钝化。 3．在未受精的胚珠培养中可以诱导单倍体植株。（获得单倍体植株的第二条途径） ⑵病毒进入植物细胞后，随植物细胞的DNA一起复制。热处理钝化病毒的活性后，子房是雌蕊基部膨大的部分，由子房壁、胎座、胚珠组成。 病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去侵染的能力。 子房培养方法：1、子房外植体的制备；2、培养子房的发育 ⑶高温下，一方面不能生成或生成病毒很少，另一方面对病毒的破坏作用加重，病毒影响子房培养的因素：培养基、激素 颗粒生成和破坏的平衡程度受到破坏，使感染植株的病毒含量不断降低，经过一段时离体授粉意义：可以克服远缘杂交过程中受精前障碍获得可育性种子。 间，病毒自行消失而达到脱毒的目的。
离体受精前障碍:花粉在柱头上不能萌发；花粉管生长缓慢不能进入胚珠；花粉管在愈伤组织培养可脱毒的原因：①细胞的增殖速度快于病毒复制的速度；②细胞产生变花柱中破裂。 异，获得对病毒感染的抗性，最终表现出脱毒现象。 离体授粉的类型：胚珠授粉、子房授粉、柱头授粉 无病毒植株的鉴定： 花粉粒引入子房的方法：①直接引入法；②注射法。 1、直接测定法：形态、症状；2、指示植物法（指示植物：接种后某种病毒能迅速表离体胚珠授粉包括：1）单个胚珠（祼露胚珠）接种、2）带完整胎座或部分胎座接种、现典型或特有症状的植物）； 3、抗血清鉴定法； 4、电子显微检测法； 5、核酸分3）哺育法。 析法。 离体受精成功的标志：在受精之后能形成有生活力的种子。受精后的胚，有的可发育第八章 突变体的诱导与选择 成种子；有的在子房上可直接长出植株。 两种突变：体细胞无性系变异；诱导变异（在培养基中加选择压（化学物质）诱导产影响离体受精的因素（保证成活率和受精率）：1、外植体；2、培养基；3、培养条件 生变异）。
第六章 植物花药和花粉培养 植物细胞工程的五个分支：脱毒与快速繁殖、细胞的大量培养、体细胞杂交、细胞遗
单倍体：指具有配子体染色体组的孢子体。或具有配子染色体数的细胞或个体。 传转化及产生转基因植株、无性系变异与分离突变体。 单倍体的发生方式 (4 种): 前两者主要利用遗传自动调节，本身遗传潜力进行繁殖；后三者则主要利用遗传变异，1、孤雌生殖；2、孤雄生殖；3、无融合生殖 创建新种质。 4、人工诱发单倍体途径（目前常用两条途径： 离体筛选的优点：1、可控程度高，便于定向选择；2、突变频率高，筛选群体大，在1)离体花粉或花药培养，诱发小孢子单性发育成单倍体植物。---花药和花粉的培养; 2) 较小容器中可操作百万到千万个植物细胞；3、与种子、芽体比较，细胞水平突变重离体培养未受精的子房和胚珠，诱导卵细胞单性发育成植物体。---胚胎培养） 复性、稳定性好。
花药与花粉培养：指离体培养花药和花粉，使小孢子改变原有的配子体发育途径，转离体筛选的意义：1、对农作物形状进行遗传改良；2、为细胞杂交和转基因技术提供向孢子体发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株，并从中鉴定出选择标记；3、对突变体细胞进行遗传及生理代谢研究。 单倍体植株后使之二倍化的技术。 变异的类型：1、农作物的品质改良；2、抗病突变体；3、抗逆突变体；4、抗除草剂花药和花粉培养的基本程序：外植体的选择—外植体（花蕾）预处理—外植体消毒—突变体。 剥取花药（—分离花粉粒）—接种—诱导培养—分化培养 变异的来源：1、离体培养细胞的自发突变 ；2. 人工诱发突变。 外植体预处理：低温度处理；离心处理；乙烯处理 体细胞无性系变异的特征表现在：随机性，无法精确地分批重复；再生植株的遗传变花药培养特点：操作程序简单，不需要游离花粉，不需要特殊培养装置。 异性广，包括染色体变异畸变，点突变，DNA序列的扩增、缺失和转座，以及线粒
体和叶绿体基因组的改变等。
人工诱发突变方法：物理方法；化学诱变。 突变体的选择方法： 1、直接选择法
通常是把细胞培养在一种亲本细胞不能生长的培养基上，或亲本细胞死亡的培养基上，即施加选择压。经诱变或未经诱变的培养组织都可用增加选择压抑制未突变细胞生长的化学物质的方法进行选择。在培养基中施加不同的选择压可以对所需要的性状进行定向选择。 2.富集选择法
在选择突变体中，确定抑制物浓度的原则是：①如果筛选对抑制剂的抗性比起始材料高许多倍的突变体，可直接利用比较高浓度的抑制剂，它这样可以缩小寻找的范围。此方法存活率极低，只要存活，便是高抗突变体。②如果需中等程度抗性的突变体，或估计只能找到这种突变体时，就选用较低浓度的抑制剂，在抑制剂浓度下能正常生长的组织继续进行培养分化成植株，就会得到所需要的抗性突变体。
在离体筛选时，由于生理上的适应性，在选择因子作用下生存下来的细胞和愈伤组织有时并未发生突变，当选择因子消失时，这种抗性也随之消失，也就是修饰变异，为了消除这种修饰变异，获得遗传性的突变，离体筛选时对选择对象（细胞或愈伤组织）原则上需要在选择压的作用下反复进行加强性的处理。
第九章 植物种质资源的离体保存
种质：是指亲代通过生殖细胞或体细胞直接传递给子代并决定固有生物性状的遗传物质。
植物种质资源（又称品种资源、遗传资源或基因资源）：是生物多样性的重要组成部分，是选育优质、高产、抗病（虫）、抗逆新品种的物质基础，是生物技术研究取之不尽的基因来源。
种质保存：是指利用天然或人工创造的适宜环境，借以保存种质资源，使个体中所含有的遗传物质保持其遗传完整性，并且有强的生活力，能通过繁殖将其遗传特性传递下去。
植物种质资源保存的方式：原生境保存；非原生境保存。
原生境保存：指在原来的生态环境中，就地进行繁殖保存种质，如建立自然保护区或保护小区，甚至保护点等途径来保护作物及经济林木的野生近缘植物物种；
非原生境保存：指种质保存于该植物原生态生长地以外的地方，包括异地保存（种质圃或植物园保存）、种质库（种子）保存、离体（试管）保存等。
种子保存存在的限制因素：①种子生活力随贮存期的延长会逐渐丧失；②无性繁殖的植物难于采用种子保存；③采用无性繁殖来保持其优良性状的植物，用种子繁殖后代会发生变异；④顽拗型种子植物因其种子不易干燥脱水和低温贮藏，不宜用种子保存或保存难度很大；⑤有些植物种质是不产生种子；⑥易遭自然灾害袭击而使种质资源丢失。
种质资源离体保存：指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理措施使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。
离体种质保存优点：①所占空间少，节省人力、物力和土地；②有利于国际间的种质交流及濒危物种抢救和快繁；③需要时，可以用离体培养方法很快大量繁殖；④避免自然灾害引起的种质丢失。
上世纪70年代以来，人们把冷冻生物学和植物离体培养技术结合起来，发展了离体种质资源冷冻保存或超低温保存技术。
常温限制生长保存：使培养物处于无生长或缓慢生长状态下抑制植物的生长，减少继代次数，达到长期保存目的。需要时可以迅速恢复正常生长。抑制生长的外植体可以是茎段、茎尖及愈伤组织。
常温限制生长保存的方法和原理
1、高渗保存法：指通过提高培养基的渗透压，减少离体培养物从培养基中吸收养分和水分的量，减缓生理代谢过程，从而减缓生长速度，达到抑制培养物生长的保存方法。
方法：1）提高蔗糖浓度；2）添加惰性物质；3）增加培养基中琼脂的用量来提高渗透压，降低培养物的生长速率。
2、生长抑制剂保存法：在离体种质保存中加入植物生长抑制剂延缓或抑制离体培养物的生长，延长继代时间，以达到离体保存种质的目的。 3、常温限制生长的其他保存法：
A、低压保存法：通过降低培养容器内氧分压或改变培养环境的气体状况，抑制离体培养物细胞的生理活性，延缓衰老，从而达到离体保存种质的目的。
B、饥饿法：从培养基中减去某种或几种营养元素，或者降低某些营养物质的浓度，或者略微改变培养基成分，使培养植株处于最小生长阶段。
植物种质资源的低温保存：指用离体培养的方式在非冻结程度的低温下（一般为1～9℃）保存种质的方法。
低温保存特点：方法简单、存活率高。
低温保存原理：温度降低以后，植物的生长速度受到抑制而减慢，老化程度延缓，因而延长了继代的时间间隔从而达到了保存种质的目的。
植物种质资源的超低温保存：将植物的离体材料经过一定的方法处理后在超低温（一般是指液氮温度，－196℃）条件下进行保存的方法。是一种种质资源保存的理想方法。
超低温保存特点：不仅能够保持生物材料的遗传稳定性，也不会丧失其形态发生的潜能（保持其再生能力）；可以节约大量的人力、物力和土地，克服长期继代培养导致的再生能力丧失；便于国际间种质资源的交流。
超低温保存原理：在液氮中植物细胞与组织的代谢活动停止、不发生遗传变异；当解冻后，细胞重新恢复生长能力。
超低温保存的基本程序：植物材料（培养物）的选取；材料的预处理；冷冻处理；冷
冻贮存；解冻处理；细胞活力和变异评价、再培养等。其中最重要的环节是冷冻和解冻处理。
在超低温离体保存种质中，已经研究或应用过的植物材料或培养物主要有三类：①愈伤组织、悬浮细胞、原生质体；②花粉和花粉胚；③茎尖、腋芽原基、胚、幼龄植物。 材料预处理：
目的：使材料适应将要遇到的低温，提高自由水含量低的新细胞的生成，避免冷冻过程中细胞内大的冰晶的形成，提高细胞的成活率和再生能力。
方法：1、加速继代；2、提高培养基渗透压3、添加冷冻防护剂（DMSO是最好的防护剂）；4、低温预处理
降温冷冻及超低温冷冻保存方法：1、传统降温冷冻方法（快速冷冻法、慢速冷冻法、两步冷冻法和逐级冷冻法）；2、玻璃化保存法；3、包埋脱水法超低温保存4、包埋玻璃化法超低温保存5、其它保存方法：（干燥法、预培养法、预培养--干燥法）。 解冻：将液氮中保存的材料取出，使其融化，以便进一步恢复培养。 解冻的速度是解冻技术的关键，可分为快速解冻和慢速解冻两种方法。
1．快速解冻法：此法融冰的速度快，细胞内的水分来不及再次形成冰晶就已完全融化，因而对细胞的损伤较轻。
2．慢速解冻法：少数超低温保存的材料只有采用慢速解冻才能存活。