采用紫外法，但因为溶菌酶中的色氨酸相对会含量高且分子量小，故溶菌酶的E=26.4，而BSA的E=6.2，因此在用280nm测定时， 溶菌酶对标准牛血清
28028010%白蛋白来说应有一个系数4。
(2) 溶菌酶活力测定：取干菌粉（M。Lysodeikticus）用0.1mol/L磷酸缓冲液配制（pH6.24）,c 20mg干粉/100ml为宜，此时悬浮液的光密度值应在0.5-0.7范围内.
(3) 取干酶粉用0.1mol/L磷酸缓冲液(PH6.24)配成1mg/ml.
留出样品(F0) 用以测定总蛋 白和酶活力
加入2g 干CM—纤维素,搅拌15分钟以吸附溶菌酶
将该悬浮液于1500*g离心5分钟 上清液(F1) 含溶菌酶的纤维素沉淀 (含除溶菌酶外的所有蛋白)
用20 ml甘氨酸缓冲液洗涤,同前友谊赛离心
上清液(F2) 再用10ml缓冲液悬纤维至少沉淀，
然后装入1cm直径的层析柱
用甘氨酸缓冲液洗术,直到没有蛋白质流出为止
柱层析流出液(F3) 用含0.5mok/LNaCL的0.1mok/L 甘氨酸---NaOH缓冲液(pH10.0)洗脱
先脱液(F4) (此即纯化的溶菌酶)
将酶液和底物悬液分别置于25C?水浴中保温10—15分钟,然后吸取底物悬浮液3ml置比色杯中，比色测定A450，此时为零时读数。然后加入酶液0.2ml(10μg酶)，迅速摇匀，从加入酶液起计时，每隔30秒测一次A450，共测3次（90秒）。
酶活力的定义为：每分钟A450下降0.001为一活力单位（25℃，pH6.2）。 每mg酶的活力数=（零时A450—60秒A450）×1000/样品μg数×1000 （3）所以获得的纯化溶菌酶也可用其它方法加以验证：如等电聚焦电泳法和SDS-PAGE法。 四、结果处理
组分 F1 F2 F3 F4 总回收量 蛋白质（mg） 酶活力（单位） 回收率（%） 比活力 起始总量（F0） 回收率c% 附：艳红K-2BP标记溶性微球菌 M.lysodeikticus的制备
1、菌体的培养与收集：取菌种Micrococcus lysodeikticus634，接种于肉汤培养基（牛肉膏0.5%、蛋白胨1.0%、NaCl0.5%、琼脂：2.5%、pH7.5压力为103.4Kpa，
灭菌15分钟）。37℃培养48~72小时后收集菌体，先用蒸馏水后用丙酮反复洗涤，最后用乙醚处理，可得到干燥菌体。
2、艳红K-2BP标记溶性微球菌M. lysodeikticus:取干燥菌体5g，加入50毫升1.25mol/LNaOH，再加2.5克活性染料艳红K-2BP（上海染化入厂生产）搅拌均匀，于25℃水浴放置24小时进行染色后，3000r/min离心10分钟收集红色菌体。染色菌体反复用蒸馏水洗涤并离心，以尽量除去末参加反应的游离染料，必要时再用强碱性711树脂在搅拌下进行处理（树脂处理成CI-型，pH7，树脂的湿重量约为染色菌体的50倍），除去未能洗尽的游离染料，反复处理直到上清液无色。由此得到净化的染色菌体，直接悬于0.5mol/L，pH6.5磷酸盐缓冲液内，制成浓度为1%底物溶液。或者将染色菌体冻干或制成丙酮粉，使用时再磷酸盐缓冲液配制。
实验十一 类胡萝卜素的提取
一、 引言
类胡萝卜素（carotenoids）属于四萜类天然产物，具有α、β、γ型异构体和番茄红素等，广泛分布在动物、植物和海洋生物中。类胡萝卜素是一类天然色素，近来的研究发现，β-胡萝卜素具有良好的捕获过氧自由基，阻止脂质过氧化的能力，可以防止和抵御多种疾病。番茄红素和β-胡萝卜素的结构如下：
二、 实验步骤
1. 从番茄酱中提取番茄红素和卜胡萝卜素的黄色素（薄层层析）
市售番茄酱含有番茄红素和卜胡萝卜素的黄色素。在50mL—圆底烧瓶中称取3—4克番茄酱，加入10mL95%的乙醇，加热回流35min。冷却后过滤，将滤纸和滤渣移回原烧瓶中，用10mL石油醚（60-90 oC）加热3min，回流、过滤，将两次滤液合并入同一锥形瓶中，加入5mL食盐水摇匀。用分液漏斗分出有机层，加入无水硫酸钠干燥。将2g硅胶、6mL1%的羧甲基纤维素钠溶液（1克CMC
溶于99mL水中）拌成糊，均匀铺在三层玻璃片上晾干。经烘箱子活化后，
用毛细管点样，用体积比为9：1的石油醚一丙酮作为展开剂在广口瓶中展开。测定Rf值。用紫外光谱测定薄板分离的物质，并与标准化合物谱图进行比较。 2. 黄杨叶中β-胡萝卜素的提取（柱层析）
称取3g洗净后用滤纸吸干的新鲜黄杨树叶，用剪刀剪碎并与5mL乙醇拌匀，在研钵中研磨。再依次用10mL乙醇，用5mL石油醚加热提取两次。将提取液合并到分液漏斗中，用10mL水分2次洗涤，移去水层。有机层用少量无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩溶液，剩余约0.5mL。
在长20cm内径为1cm层析柱中加入2/3高度的石油醚，用20g层析用中性氧化铝（150—160目）进行湿法装柱（见柱层析基本操作）。将黄杨叶浓缩液用
滴管小心加到曾析柱顶部，加完后打开下端活塞，放出溶剂，使液面下降到柱面以上1cm左右，关闭活塞，加入数滴石油醚，重新打开活塞，重复数次，使有色物质全部进入柱体内。保持流出速度，当第一个有色物质流出时换另一个锥形瓶接收，即得橙黄色溶液。可以点板测定Rf值或进行紫外光谱分析。 三、 思考题
1. 薄层层析中的Rf值有什么意义？不同的展开系统对Rf值会有什么影响？ 2. 番茄红素和β-胡萝卜素相比哪一个Rf值大？颜色有何不同？为什么？ 3. 在提取液中加入干燥剂的目的何在？加入饱和食盐水的作用是什么？ 4. 本实验中进行薄层层析时是怎样显色的？为什么不用硅胶GF254制板？