基
因 芯 片 技 术 及 其 应 用
姓名：杨静 学号： 专业：植物病理学
11206004 基因芯片技术及其应用
摘要：基因芯片是近年来产生的一项生物高技术.它是一种高通量、快速、平行核酸序列测定及定量分析技术。基因芯片技术是将大量特定序列的核酸片段有序地固定在载体上作为探针与标记核酸分子进行杂交，检测杂交信号的强弱，进而判断样品中靶分子信息。目前基因芯片技术广泛应用于基因表达水平的检测、基因点突变及多态性检测、DNA序列测定、寻找可能的致病基因和疾病相关基因、蛋白质作图、基因组文库作图等方面,是一种发展前景良好的新兴检测手段。文章介绍了基因芯片技术的产生与发展、工作原理、种类和制备过程，以及在各个方面的应用。
关键词：基因芯片技术、序列测定、应用、前景
一、基因技术的产生与发展
基因芯片技术是20世纪90年代发展起来的一项前沿生物技术。随着人类基因组计戈Ⅱ的初步完成和一些其他真核生物的全基因组序列测定完成后，基因组计划从而转向从发现基因到探索基因功能的后基因组时代。生物基因组的功能，特别是基因互作和调控关系的研究迫在眉睫，故需要一种能大规模、高通量、同时地进行成千上万个基因在各种生理状态下表达状况的研究方法【1]，此时，基因芯片技术便应运而生。
基因芯片（又称 DNA 芯片、生物芯片）技术就是顺应这一科学发展要求的产物，它的出现为解决此类问题提供了光辉的前景。
基因芯片技术的理论基础是核酸杂交理论，Southern印迹可以看作是生物芯片的雏形；其后，人们又发明了一个以膜片为介质基础的克隆库扫描技术，引入了克隆与杂交型号相对应的概念，在此基础上，分格筛选技术得到了应用；1989年Ed Southern提出了利用在玻片表面固定的核苷酸探针进行基因序列测定的实验设计；而真正使基因芯片技术发展并实用化的，是得益于非孔固相支持介质的使用和高密度原位合成核苷酸两项技术的发明，从而推进了基因芯片产品的商业化。在美国硅谷，1991年;Affymax 公司开始了生物芯片的研制，1992年从 Affymax派生出来的世界上第一家专门生产生物芯片的公司Affymax宣告成立。Forder现任Affymetrix总裁）及其同事在20世纪90 年代初发明了一种利用光刻技术在固相支持物上光导合成多肽的方法，在此基础上于1993年设计了一种寡核苷酸生物芯片，1996年制造出了第一块商业化的基因芯片。1994 年在美国能源部防御研究计划署、俄国科学院和俄国人类基因组计划1000多万美元的资助下研制出了一种生物芯片，用于检测β-地中海贫血病人血样的基因突变。1998年美国的纳米基因公司（Nanogen）利用生物芯片在世界上构建了首例缩微芯片实验室，该成果被美国期刊选入1998年世界10大科技突破之中。
最近几年，国际上掀起了基因芯片设计热潮，使基因芯片技术得到不断完善和发展，出现了多种芯片技术。最初的芯片主要目标是用于DNA序列的测定、基因表达图谱鉴定及基因突变体的监测和分析，因此称为基因芯片。但目前这一技术已扩展到非核酸领域，如已出现了蛋白质芯片分析技术、Biacore 技术和丝网印刷技术等。在这一发展趋势下，芯片技术现多被称为生物芯片技术。
二、基因芯片技术
2、1技术原理
基因芯片（Gene Chip），又称DNA芯片、DNA微阵列（DNA Micrcarray）、寡核苷酸阵列（O），是指将大量已知序列的核酸或蛋白质片段有序地组合在一个微小基片表面，通过与标记的核酸或蛋白质进行杂交，利用特定的仪器，检测杂交信号的强弱，从而实现对生物样品快速、高效检测的目的［!］。
2、2 制作方法
目前适用于制作芯片的载体材料主要有半导体硅片、玻璃片、金属片、各种有机高分子制作的薄膜等，其中以载玻片最常用。基因芯片的制作一般有2 种方法，一种为原位合成，适用于寡核苷酸；一种为合成后交联（微点阵），多用于大片段DNA，有时也适用于寡核苷酸，甚至mRNA。
2.2.1 原位合成法
此方法制作的芯片常被称作DNA 芯片，即在芯片上原位合成寡核苷酸探针，合成的探针被直接有序地固化于支持物上，以用于杂交分析。原位合成法制备的芯片是高密度的，核酸探针长度一般小于25mer，最适用于DNA 再测序、查明点突变，以及基因转录表达分析等。在固相介质表面制作基因芯片的方法有以下几种。
(1)光导原位合成法
在经过处理的载玻片表面铺上一层连接分子（linker），其羟基上加有光敏保护基团，可用光照除去，用特制的光栏（light mask）保护不需要合成的部位，而暴露合成部位。在光作用下去除羟基上的
保护基团，游离羟基，利用化学反应加上第一个核苷酸，所加核苷酸种类及在芯片上的部位预先设定，引入的核苷酸带有光敏保护基团，以便下一步合成。然后按上述方法在其他位点加上另外3种核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而N个核苷酸长的芯片需要有4N个步骤。每一独特序列的探针称为一个“feature”，这样的芯片便具有4N个“feature”（探针位点，每个探针位点含有几百万个相同的探针），包含了全部长度为N 的核苷酸序列。
(2)电压打印法
除了光导原位合成法以外，原位合成芯片的方法还有电压打印法。该法是美国Incyle Pharmaceutical 公司等采用的，其技术原理与喷墨打印机相似。由打印机将4 种核苷酸合成试剂分别打印到经包被的
支持物的特定区域上，然后冲洗、去保护，进行寡核苷酸合成的下一循环。合成探针可达40~50mer，每步产率可达0.99。
(3)流体通道合成法
在玻璃介质的表面铰链一系列的1mm硅胶管，形成通道，DNA合成试剂被引入通道，通过变换微 流体模板，可以在玻片上合成不同序列的寡聚核苷酸探针。 (4）分子印章法
其原理是通过光刻硅胶板，形成分子印章，涂覆DNA合成试剂，按一定顺序压印在基片表面，合成不同的寡聚核苷酸探针。
(5)机械点涂法
通过高精密机械控制的墙头与芯片表面接触而将寡聚核苷酸定位点滴到芯片特定的位置上。
2.2.2 合成后交联法
以此方法制作的芯片多被称为微点阵，即将较大的核酸片段（大于100bp）物理地固定在介质上。该方法的探针制备是在芯片以外采用常规分子生物学技术获得的，如PCR、分子克隆、人工合成DNA 片段等。将制备好的探针通过手工或自动点样装置点在经特殊处理的载玻片或其他材料上即可，主
要用于诊断、检测病原体及其他特殊要求的中、低密度芯片的制备。
2、3 分类
2.3.1 载体材料分类
就基因芯片所用的载体材料而言，可分为玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯片。目前，玻片材料因易得、荧光背景低、应用方便等优点在国际上被广泛接受。通常在玻片上接上活性基团，如氨基、醛基、巯基等，使DNA 分子通过共价键或离子键牢固地固定在玻片上。
2.3.2 点样方式分类
根据芯片点样方式不同，可分为原位合成芯片、微矩阵芯片。
原位合成法与微矩阵法相比，有以下的优点：（1）原位合成直接从cDNA 数据库中得到信息合成寡核苷酸，避免了cDNA 样品获得及制备过程中的不确定因素。而微矩阵法样品必须事先准备和保存。（2）原位合成减小了片与片之间的差异，可保证芯片的高精确度。（3）原位合成法制备的芯片密度高，目前最高可达4 X 105 个寡核苷酸/ 1. 6 Om2。而微矩阵目前最高只有64 500 个基因/ 6. 5 Om2，通过技术的改进将来可达1 X 105 个基因/ 6.5 Om2。但原位合成法与微矩阵法相比，又有以下的缺点：（1）成本高；（2）设计和制备繁琐、耗时。正是由于微矩阵芯片成本低、容易操作，而且其点样密度通常能满足需要，因此更广泛得到推广。
2.3.3 DNA 种类
分类按照载体上所点的DNA 的种类不同，芯片可分为寡核苷酸和cDNA芯片两种。 (1) 寡核苷酸芯片
寡核苷酸芯片一般以原位合成方式固定到载体上，具有密集程度高、可合成任意序列的寡聚核苷酸等优点，适用于DNA 序列测定、SNP 分析等。但其缺点是合成寡聚核苷酸长度有限，因而特异性差，而且随长度的增加，合成错误率随之增高。寡核苷酸芯片也可通过直接点样制备，但固定率不如cDNA 芯片高。寡核苷酸芯片主要用于点突变和测序等，也可以用于表达谱研究［11，12］。
(2)cDNA 芯片
cDNA 芯片是将微量cDNA 片段在玻璃等载体上按矩阵密集排列并固化，基因点样密度虽不及原位合成寡聚核苷酸芯片高，但比用传统载体，如混合纤维素滤膜或尼龙膜的点样密度要高得多，可达到每张载玻片6 万个基因。cDNA 芯片最大的优点是靶基因检测特异性非常好，目前许多国家实验室和大制药公司都用此类芯片。cDNA芯片主要用于表达谱研究［4，5］。
2.3.4 用途分类
按基因芯片的用途可分为表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片和毒理芯片等。
三、基因芯片的使用操作
基因芯片操作的基本过程如下：分离纯化的生物样品先进行扩增、标记，然后与芯片上的探针阵列杂交，再对杂交信号进行检测与分析，最后得出待测样品的遗传信息。
3、1样品的准备
从血液或组织中得到的生物样品（DNA 或mDNA）一般不能与芯片反应，需进行一定程度的扩增，而且对样品中的靶序列（靶分子）需进行高效而特异的扩增，以获取样品中的靶分子，如cDNA 片段,PCR. 产物、mDNA、寡核苷酸等。靶分子的标记主要采用荧光标记法，也可用生物素、放射性同位素等标记。样品的标记在其PCR、RT-PCR 扩增或逆转录过程中进行。常用荧光色素Cy-3、Cy-5或生物素标记dNTP. DNA聚合酶选择荧光标记的dNTP 为底物，参与引物延伸，这样新合成的DNA 片段中就掺入了荧光分子。对于cDNA一般是在反转录过程中掺入荧光基因![25]。
3、2 分子杂交
在此步骤中发生靶标样品核酸分子与（芯片）探针之间的选择性反应。芯片杂交属于固$液相杂交，与膜上杂交相似。芯片杂交中固定在芯片上的往往是成千上万的核酸探针，而与之杂交的则是经过标记的核酸样品。待测样品经扩增、标记等处理后，可与基因芯片上探针阵列进行分子杂交。靶分子与探针分子之间的杂交是芯片检测的关键一步，杂交条件因靶分子的类型不同而有所不同。探针的浓度、长度，杂交的温度、时间、离子强度等因素都是影响杂交效果的关键因素。因此，要根据探针的类型