DNA浓度的检测

2020-04-14 16:11

可以。DNA的碱基在260nm处有吸收。用紫外分光光度计测260nm处DNA分子的OD值,就能通过朗伯-比尔定律OD=εlc换算出浓度。式子里l是吸收光路的长度;c是浓度,单位一般用μg/ml;ε是吸光系数,双链DNA一般取0.02ml/(μg·cm),单链DNA因为增色效应,ε要大一些,取0.05ml/(μg·cm)。 如果知道一个DNA片段的碱基数,还可以换算出DNA片段的物质的量浓度。 取1μDNA,用ddH2O水稀释到1ml,以1ml ddH2O为对照,紫外分光光度计测定OD260,OD280,OD260/OD280(都在 1.8左右之间,说明 DNA样品纯度较高),concentration。

另,基因组DNA1%的琼脂糖凝胶电泳检测均呈现完整清晰条带没有拖尾,说明 DNA 样品的完整性好,也可通过DNA marker 推算出DNA浓度。

目的: 了解紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理,掌握测定方法。 原理: 核酸的最大吸收波长为260nm,蛋白质为280nm,在波长260nm时,1OD值相当于双链DNA浓度为50μg/ml,单链

寡核苷酸的含量为30μg/ml,可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值

(OD260/OD280),估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为1.8, RNA为2.0。若比值高于1.8说明DNA样品中的RNA尚未除

尽,若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。 紫外分光光度法只能用于测定浓度

大于0.25μg/ml的核酸溶液,对浓度更小的样品,可采用荧光分光光度法。

试剂与仪器: 提取的质粒DNA,紫外分光光度仪。 操作步骤:

1) 分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。

2) 取质粒DNA样品2μl,用水稀释100倍,转入分光光度计的石英比色杯中。

3) 在260nm和280nm分别读出样品光密度值。如果样品浓度单位为μg/μl,则样品DNA浓度为OD 值的10倍,即如 OD260=0.1,则样品浓度即为1μg/μl。

4) 若OD260/OD280大于1.8,说明仍有RNA,可以考虑用RNA酶处理样品,若小于1.8,说

明样品中含有蛋白质或酚,应再用酚/氯仿抽提,以乙醇沉淀纯化DNA。

“1od=0.05ug/ul”这个说法很不严谨。按照我的理解,这句话的意思是:在光程为1cm的吸收池内,测得双链DNA的OD值为1时,DNA溶液的浓度为0.05μg/μL。 因为OD=εlc,这里OD=1,光程l通常都是1cm,双链DNA的吸收系数ε=0.02mL/(μg·cm),那么浓度

c=OD/(εl)=1/[0.02mL/(μg·cm)*1cm]=50μg/mL=0.05μg/μL。

楼主的测定在类似条件下,所以l=1cm,ε=0.02mL/(μg·cm),而OD=0.45,所以浓度c=OD/(εl)=0.45/[0.02mL/(μg·cm)*1cm]=22.5μg/mL=0.0225μg/μL。

实验准备工作:

1 所用离心管、枪头要洗净、烘干(最好灭菌)。 2 试剂配制:

1 M Tris-HCl (pH 8.0): 称取Tris-Base 121g, 加入约800 ml 水在磁力搅拌器上搅拌,使其充分溶解后加入浓盐酸调整pH至8.0后加水定溶至1000 ml. 灭菌后于室温保存。

0.5 M EDTA (pH 8.0): 称取EDTA-Na2盐 187 g 加入约 800 ml水,在磁力搅拌器上边搅拌边加入固体NaOH,当EDTA和NaOH均完全溶解,溶液变清时其pH值刚好达到8.0左右,再用pH试纸略加调整即可, 灭菌后于室温保存。

5.0 M NaCl: 称取NaCl 300 g, 加入蒸馏水约800 ml 于磁力搅拌器上充分搅拌,约5分钟后停止搅拌,静止2~3分钟,倒出上清液,再加入100 ml蒸馏水重复前面的步骤,直到NaCl充分溶解后定溶至1000 ml., 灭菌后于室温保存。 酚:氯仿:异戍醇(25:24:1)的配制:可参考《分子克隆》亦可按如下方法配制取重蒸酚100 ml ,蒸馏水50 ml,8-羟基喹咛0.05g 加入500 ml玻璃烧杯于磁力搅拌器上边加热边搅拌,待酚达到水饱和后加入18 g Tris-Base,等Tris-Base 完全溶解后加入100 ml氯仿:异戌醇(24:1),搅拌10~20分钟,静止约10分钟,除去上层水相后,装入棕色瓶,最后加入20 ml 0.1M的Tris-HCl保护液于4℃保存。 DNA Buffer的配制: 1 M Tris-HCl (pH 8.0) 0.5 M EDTA (pH 8.0): 5.0 M NaCl: H2O

100 ml 100 ml 300 ml 500 ml

灭菌后于室温下保存3个月左右,用时按1.5%往Buffer中加入CTAB,在电炉上烧开;在通风橱里加入1%的巯基乙醇( 现配现用)。

DNA的提取:

1 取2~5 g叶片或愈伤组织,加入适量液氮研碎,转入预冷的50ml离心管,

加入20 ml DNA提取缓冲液充分摇匀,于65℃水浴60~90 min,中途轻轻摇匀两次。

2 加入15 ml 氯仿:异戍醇(24:1)轻轻摇匀10分钟,于BECKMAN离心机

中4000 rpm离心15分钟。

3 取上清液于另一50 ml离心管加入10 ml 氯仿:异戍醇(24:1)重复步骤2。

4 吸上清液于一干净的50 ml 离心管,加入15 ml 冷冻的异丙醇,轻轻摇匀

后于-20℃冷冻半小时,4000 rpm离心10分钟。弃上清液,加入5 ml 76%的乙醇(含10 mM

NH4Ac)浸泡5 h(或过夜),中途换乙醇2-3次。

5 弃乙醇风干沉淀约半小时,加入3.0 ml TE缓冲液(10 mM Tris-HCl pH 8.0;

1 mM EDTA , pH 8.0),20 μl RNase A(10 mg/ml),37℃温浴过夜。 6 溶液转入一10 ml离心管,加入3.0 ml苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)

充分颠倒混匀,4000 rpm离心15 min,吸上清液于另一10 ml的离心管中,(可重复一次)。

7 加入1 ml 5.0 M的NaCl和3.0 ml水饱和乙醚,充分混匀,4000 rpm离心5 min。

8 弃乙醚,用20 μl枪头挡住离心管管口内侧,用力下压枪头,使枪头与管壁

间形成一狭缝,让下清液从缝中流入另一10 ml离心管。

9 加入5 ml冷冻的异丙醇,轻轻摇匀后于-20℃冷冻半小时,4000 rpm离心

10分钟。弃上清液,加入3 ml 70%的乙醇浸泡4~6 h(或过夜),中途换乙醇2-3次。风干乙醇,加入500 μl TE溶解,或浸在乙醇中长期保存。 DNA检测

1 取DNA原液15 μl稀释至3.0 ml,用UV-1601型紫外分光光度计测定230 nm、 260 nm及280 nm的吸光值。

高质量的DNA要求:A260/A230>2.0; 1.7

2 将DNA原液适当稀释后,用1 Χ TAE,0.8%琼脂糖凝胶2V/cm电泳1 h进

行质量检测。

3 向一定量的DNA中加入限制性内切酶EcoR I至4-5U/μg DNA,37℃消化过

夜,用0.5 Χ TBE,0.8%琼脂糖凝胶2.5V/cm电泳3 h进行检测。

CTAB法微量提取DNA

1. 药品的配制: CTAB提取液:

(1)100mM Tris-HCl(PH 8.0),1.5M NaCl,50mM EDTA(PH 8.0) (2)1% PVP,2% CTAB

(3)取少许(1)加到(2)中,搅拌成糊状,后加(1)至足量,65℃水浴充分溶解备用。使用前要在65℃温浴一会儿,然后加入1-4%巯基乙醇,混均匀。 苯酚:氯仿:异戊醇(25∶24∶1): 重蒸酚65℃水浴溶解,在烧杯中加入80ml温热的蒸馏水,加入少许8-羟基喹啉,溶解后加入100ml重蒸酚,再加入100ml氯仿:异戊醇(24:1),加入20克Tris Base,磁力搅拌器上搅拌1.5 h左右至停止搅拌后很快分层,然后装入棕色瓶中,4℃冰箱中储存备用。

2. 材料的采取与保存:

在超净工作台上,取试管苗叶片,放入无菌的1.5 ml离心管中,置于冰盒中,然后把装有叶片的离心管一起装在纱布袋中,置液氮中冷冻10分钟,取出后置于—70℃冰箱中可长期保存,需要用时,取出置于冰盒中。 3.DNA的粗提


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