癌基因特别有效，但仅限于有着polyA尾巴的基因，很难获得基因间隔区域和UTR区域上的信息。
大多数RNA-Seq分析比对的算法假设RNA序列中的所有相关序列片段均来自同一个染色体，而基因融合的两个基因往往来自两个不同染色体，例如断裂-融合-桥接循环所产生的基因融合。对于这类情况，传统算法往往无法检测或正确拼接。
许多研究使用培养的细胞系，肿瘤细胞系更是癌症研究的常规工具，但这些细胞系能在多大程度上代表原发肿瘤仍不清楚。天生不稳定的细胞系经过长时间培养后可积累大量突变，而培养过程中种群减少所造成的遗传瓶颈又会大大加速突变的累积。
目前大部分发表的研究所包含的样品数量是非常少的，所以大部分测序研究被认为是假设推导生成的。在测序实验的设计中，许多未解决的问题仍然存在，例如我们还不清楚在测序实验中如何应用多重检验纠正。随着更多的测序信息出现，大部分癌症类型可根据其分子表型划分为几种亚型，这使得实验本身的作用严重降低，而可靠分析所需的样品数量却大大增加。我们预计未来为获得统计学上可靠的的结果，测序实验的样本量会非常大，达到成千上万。 基因组突变
所有癌症在发展过程中都会积累大量体细胞突变，其中司机突变是对癌症发展很关键的体细胞改变，而剩下的就被称为乘客突变。目前研究人员已经编制出一些癌症类型的体细胞突变综合目录。
Berger, M.F., Lawrence M. S., demichelis F., Drier Y., Cibulskis K., et al. (2011) The genomic complexity of primary human prostate cancer. Nature 470: 214 - 220
这篇文章展示了一些原发性人类前列腺癌及其配对正常组织的完整基因组序列。一些肿瘤包含复杂的平衡重排链（拷贝数中性），它们发生在已知癌基因中或附近。一些断裂点发生在基因间区域，可能会被靶定外显子测序的方法错过。在88%的病例中，融合点可定位到单碱基分辨率。最常见的融合类型涉及到一个精确连接，其重排连接处既无重叠也无插入序列。这一结果与乳腺肿瘤中所发现的模式不同，后者最常见的连接涉及到一个2-3 bp的微同源序列，这表明前列腺癌和乳腺癌负责产生这些融合的机制是不同的。这篇文章例证了有些突变只有通过全基因组测序才能检测出来。 癌症研究概览9：染色体碎裂 摘要：
染色体破裂是一个一次性的细胞危机，成百上千个基因组重排在单次事件中发生。这种灾难性事件的后果是复杂的局部重排和拷贝数变异，其范围限制在0-2个拷贝。这种单一灾
难性事件的模式不同于癌症发展逐步积累突变的典型模式。在突变积累的癌症发展模式中，拷贝数无上限，因此通常可看到很大范围的差异。 染色体碎裂
染色体破裂是一个一次性的细胞危机，成百上千个基因组重排在单次事件中发生。这种灾难性事件的后果是复杂的局部重排和拷贝数变异，其范围限制在0-2个拷贝。这种单一灾难性事件的模式不同于癌症发展逐步积累突变的典型模式。在突变积累的癌症发展模式中，拷贝数无上限，因此通常可看到很大范围的差异。据估计，染色体破裂发生在2-3%的癌症的多个亚型中，以及~25%的骨癌中。 实验设计上的注意事项：
染色体重排的复杂性和随机性让它成为一种很难研究的现象。应当使用末端配对和mate-pair（长距离末端配对）技术建库的全基因组深度测序方法。
Rausch, T., Jones D. T., Zapatka M., Stutz A. M., Zichner T., et al. (2012) Genome Sequencing of Pediatric Medulloblastoma Links Catastrophic DNA Rearrangements with TP53 Mutations. Cell 148:59–71
作者报道了一名Sonic-Hedgehog恶性脑肿瘤成神经管细胞瘤（SHH-MB）患者的大量、复杂的染色体重排，该患者带有生殖细胞系TP53突变（Li-Fraumeni综合征）。在对11名Li-Fraumeni综合征患者的进一步筛查中，36%的肿瘤表现出与染色体破裂一致的重排，这比一般肿瘤群体所观察到的2%染色体破裂发生率要高得多。P53生殖细胞系的突变与一些肿瘤中染色体破裂导致凋亡中止的假说是一致的。
Illumina测序技术：GAIIx和HiSeq 2000系统，paired-end和mate-pair方法测序 染色体重排
染色体重排需要DNA双链断裂和一定方式的排列连接。这些事件破坏了基因组的完整性，经常参与形成白血病、淋巴瘤和肉瘤。多个个体中特异基因之间基因融合的反复出现表明，这些基因在细胞周期的某个阶段必定靠得很近。
Hakim, O., Resch W., Yamane A., Klein I., Kieffer - Kwon K. R., et al. (2012) DNA damage defines sites of recurrent chromosomal translocations in B lymphocytes. Nature 作者通过测定了小鼠B淋巴细胞中的相关参数研究了细胞核结构和DNA损伤频率在染色体易位发生中的作用。在缺乏经常性的DNA损伤时，Igh或Myc与其他所有基因之间的易位与它们的接触频率直接相关；相反，与经常性位点指向的DNA损伤相关的易位与DNA断裂形成的速率成正比，这通过损伤位点的复制蛋白An积累就能测定出来。因此，非定向重
排反映了核结构，而DNA断裂方式控制了经常性易位的位置和频率，包括那些驱动B细胞恶性肿瘤的易位。
癌症研究概览10：基因组改变和拷贝数变异（CNV） 摘要：
新一代测序技术为以单碱基分辨率快速确定大量样本中的畸变提供了一套工具。大的样品组让我们能确定基因组改变的频率，并深入了解驱动疾病发展的关键基因和过程。使用这些技术的早期文章让我们初步感受到未来可预见的海量信息。最让人吃惊的现象是每个癌症是那么独特。
基因组改变和拷贝数变异（CNV）
基因组改变是癌症的特征，许多种类癌症携带特有的畸变，它们为疾病的成因和预后提供线索。基因组改变随癌症发展而积累，因此同一个肿瘤中癌症基因组的异质性很常见，也被称为克隆类型。这其中大部分进程目前技术已能观察到，但对从事研究的实验室来讲现有技术仍属费时费力且样品处理量有限。新一代测序技术为以单碱基分辨率快速确定大量样本中的畸变提供了一套工具。大的样品组让我们能确定基因组改变的频率，并深入了解驱动疾病发展的关键基因和过程。使用这些技术的早期文章让我们初步感受到未来可预见的海量信息。最让人吃惊的现象是每个癌症是那么独特。
结构变异影响基因剂量，即可转录基因的功能拷贝数。肿瘤发展和耐药性通常是由潜在的基因扩增和删除驱动的。这些基因组改变可分成大的畸变：如整个染色体或部分染色体的丢失，这称之为非整倍体；小的畸变：可能只跨越一个碱基，如点突变和插入缺失的情况。与健康基因组基因表达的改变受到转录因子的严格调控不同，癌症基因组则通过基因的复制和删除来适应。耐药性的发展正是此反应的速度和效率的绝佳证明。 实验设计上的注意事项：
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分析中只关注SNP将错过大部分重要的基因组重排。据估计，每个人类基因组中“非SNP变异”总共约有50 Mb。
个别算法往往专注于特定大小和类型的变异发现，研究人员通常综合使用几种算法。
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基因表达
基因表达分析为细胞的分子功能提供线索。基于芯片的mRNA分析曾被广泛使用，以研究癌症中的基因表达。但基于测序的mRNA分析（mRNA-Seq）的出现代表我们测定和解释基因表达产物能力的又一次飞跃，mRNA-Seq检测经过修饰的RNA和表达水平极低的RNA
的能力让它特别适合癌症研究。这些方法经过开发，可以检测非常快的转录变化以及选择聚腺苷酸化位点。 实验设计上的注意事项：
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RNA-Seq已成为一种常规的研究手段，大部分研究人员使用厂商推荐的实验操作步骤。
癌症中的体细胞突变基本上是de novo，而测序方法无需突变的先期知识，非常适合准确定位突变位点和转录丰度。
剪接变异和基因融合在某些癌症中发挥了重要作用。末端配对的mRNA-Seq可定位剪接变异体和融合基因，包括不完整的融合。
肿瘤组织往往是包含正常细胞混合物，mRNA-Seq的超过10的5次方的动态范围和准确性能检测出很小的表达变化，把包含独特的体细胞突变或剪接变异体的肿瘤转录本与正常细胞的区分开来。
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? 末端配对、大规模平行测序检测基因融合的灵敏度取决于许多因素，包括表达水平、转录本长度和cDNA文库的片段长度。
传统RNA测序采用polyA富集的mRNA，无法对polyA-（不包括rRNA）RNA进行分析，而后者也可能在细胞中发挥重要的生物学作用。通过现在的RNA-Seq测序方法，可以轻松分析这类RNA。
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RNA表达具有组织和细胞类型特异性，在选择肿瘤-正常对照时应考虑这一点。 组织培养物并不代表组织中真实的表达情况，需谨慎使用。
癌症研究概览11：microRNA（miRNA） 摘要：
容易测定、相对稳定、对mRNA具有调控作用，这些特点让miRNA有潜力成为许多疾病包括癌症的标志物，但任何新发现的候选miRNA想要成为合格的生物标志物，还有很长的路要走。迄今为止的研究仍处于生物标志物发现的极早期阶段，下面的文章介绍了这一快速发展领域的技术和进展。 MicroRNA（miRNA）
成熟的miRNA通过翻译抑制或增强mRNA降解来调控基因表达。许多miRNA都位于不同类型癌症中删除或扩增的基因组区域，在大部分癌症类型中都观察到miRNA表达水平的整体下降。癌症研究中miRNA的研究大致可分为两大类：第一类是发现癌症发展中起作用的miRNA并注释功能，第二类是miRNA作为癌症检测和分期标志物的潜在应用研究，以此改善癌症的诊断和治疗。
容易测定、相对稳定、对mRNA具有调控作用，这些特点让miRNA有潜力成为许多疾病包括癌症的标志物，但任何新发现的候选miRNA想要成为合格的生物标志物，还有很长的路要走。迄今为止的研究仍处于生物标志物发现的极早期阶段，下面的文章介绍了这一快速发展领域的技术和进展。 参考文献：
Hou, J., Lin L., Zhou W., Wang Z., Ding G., et al. (2011) Identification of miRNomes in human liver and hepatocellular carcinoma reveals miR-199a/b-3p as therapeutic target for hepatocellular carcinoma. Cancer Cell 19: 232-243
Farazi, T. A., Horlings H. M., Ten Hoeve J. J., Mihailovic A., Halfwerk H., et al. (2011) MicroRNA sequence and expression analysis in breast tumors by deep sequencing. Cancer Res 71: 4443-4453 实验设计上的注意事项：
miRNA的制备和测序已成为常规实验方法，用户根据厂商提供的标准操作步骤就能获得具有非常高的灵敏度和特异性的数据。更需重视的是与高质量数据相匹配的实验设计和数据分析方法。
测序深度与检测灵敏度直接相关。在一个典型的实验中，当流动槽(flow cell)的一个通道中只加入一个样品时，测序深度会非常高，其检测灵敏度也极高。因此，miRNA读取深度很少成为考虑因素。在不需要如此高水平检测的研究（如筛查）中，几个样品可分别加上带不同index标记的接头上到flow cell的同一个通道中。在决定测序覆盖深度时，记住miRNA控制基因表达，而miRNA水平的细微变化就能影响许多编码蛋白的基因。 新发现的miRNA应当通过功能分析，如Ago2结合实验或敲除实验来证实。
实验应当包含足够数量的样品，以建立统计学可信度。多名患者肿瘤中一个miRNA的存在足以创建此假设，即miRNA可能在疾病中发挥作用。通常需要大量患者来检验此假设，并建立统计学可信度。目前对于在测序研究中建立统计学可信度和多重检验纠正，还没有公认的方法。基于测序的miRNA分析并不能测定miRNA表达的绝对量，而是不同miRNA（如在肿瘤-正常细胞）的相对量。
分层性是癌症样品共有的问题，不同的病因和机理往往共有一个特定的癌症表型。因此，严格的分析需要有足够的样品量，才能充分代表每个肿瘤亚型。miRNA表达可随肿瘤发展而变化，因此实验设计中应包含对肿瘤分期的考虑。目前对于发现生物标志物实验流程的要求和设计思路已相当成熟，任何新发现的标志物必须在大的、独立的群体中验证。