实验 同系物的高效液相色谱法分析
实验目的
1、了解高效液相色谱仪的原理及结构。 2、了解反相色谱的优点和应用。
3、掌握液相色谱微量进样器进样技术。
实验原理
液相色谱法是以液体作为流动相的色谱法。 高效液相色谱法是在经典液相色谱法基础上发展起来的一种新型分离、分析技术。经典液相色谱法由于使用粗颗粒的固定相，填充不均匀，依靠重力使流动相流动，因此分析速度慢，分离效率低。随着新型高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱技术以及各种高灵敏度的检测器相继发明，高效液相色谱法得到了迅速的发展。
高效液相色谱法是利用样品中各组分在色谱
图1 高效液相色谱仪结构示意图
柱中固定相和流动相间分配系数或吸附系数的差异，将各组分分离后进行检测，并根据各组分的保留时间和响应值进行定性、定量分析。
在液-液分配色谱法中，当固定相的极性大于流动相的极性时，称为正相色谱；反之，流动相的极性大于固定相的极性时，称为反相色谱。本实验采用反相色谱分离方法对对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯样品进行分离、分析，定性分析采用的是利用已知物进行对照的方法；定量分析采用归一化法。
图2 旋转式六通阀结构和工作原理
尼泊金甲酯亦称对羟基苯甲酸酯,由于它具有酚
(a) 采样位 (b) 进样位
羟基结构,所以抗细菌性能比苯甲酸、山梨酸都强。应用于食品和化妆品中。
仪器与试剂
仪器 高效液相色谱仪（LC-20AT，日本 岛津 公司）；紫外检测器（SPD-20A，日本 岛津公司）；LCsolution Multi-PDA色谱工作站（日本 岛津 公司）；ODs色谱柱（C184.6?250mm，中科院大连化物所）；定量环：20μL；平头微量进样器；超声波清洗机；0.45μm有机相滤膜，过滤器。
试剂 乙腈（色谱纯）；超纯水；对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯（均为分析纯）。
标准储备液的配制 于两只100ml容量瓶中分别配制浓度为1000μg/ml的尼泊金甲酯和尼泊金乙酯的乙醇溶液，摇匀备用。
标准使用液的配制 于两只10 ml的容量瓶中分别用上述标准储备液配制10μg/ml的尼泊金甲酯和尼泊金乙酯的乙醇溶液，摇匀备用。
标准混合使用液的配制 于一只10ml容量瓶中取上述标准储备液配制10μg/ml的尼泊金甲酯和尼泊金乙酯的乙醇混合溶液，摇匀备用。
实验步骤
1、按操作说明打开计算机和色谱仪，建立测定方法，设定色谱条件为： 流动相：乙腈／水梯度洗脱；流动相流速：1.0mL·min-1； 检测波长：254nm；柱温：室温。
2、所有供试液均需经0.45μm滤膜过滤后方可进入仪器分析。
3、分别取上述标准样品供试液和混合样品供试液进行分析，重复两次，记录各样品对应的实验数据。
数据与处理
1、记录色谱条件。
2、根据标准样品色谱图确定各组分的保留时间，并通过保留时间对混合样品进行定性分析。
3、测量混合物色谱图中各组分的峰面积，由归一化定量方法计算各组分含量。
数据记录表格： 组 分 保留时间（tR） 峰面积（A） 备注 标准溶剂峰 样品 对羟基苯甲酸甲 酯 对羟基苯甲酸乙 酯 未知1号峰 样品 2号峰 3号峰 定性结论 数据处理：
思考题
1、 高效液相色谱柱一般可在室温下进行分离，而气相色谱柱则必须恒温，为什么？ 2、 说明紫外光度检测器的工作原理。
3、 观察分离所得色谱图，解释不同组分之间分离差别的原因。