RNA的提取
1. 试验所用试剂的配制
(1) 含0.1TPC(二乙基焦磷酸酰胺)的灭菌水<实验过程中用>
0.1mlDEPC+99.9mlddH2O<瓶子事先用0.01TPC水浸泡2-3d灭菌后可用>。配好后灭菌，高压灭菌的目的是使DEPC分解，未分解的DEPC会影响后面的实验。所以需要放在通风厨中挥发至少3小时，一般都要放置过夜。用1.5ml的进口去RNA酶的doff管分装该DEPC水，置-20度储存，需要实验的人可以领取一支，使用后放置自己的-20度中下次可以继续使用，只需要注意使用的时候都用去RNA酶的枪头及相关的注意操作即可。 (2) 0.01TPC的灭菌水。<用于浸泡瓶子器材等除去Rnase用> (3) 琼脂糖凝胶电泳所用试剂配制与准备 ① 0.5mol/L PH=8.0的EDTA溶液
将37.2g EDTA-Na加入160ml的蒸馏水中，于搅拌器上剧烈搅拌。再用NaOH调其PH值至8.0(约需4g NaOH)。之后用蒸馏水定容至200ml，后送至高压灭菌，室温保存。 ② 50×TAE溶液
在400ml蒸馏水中溶解121g Tris,加入28.55ml冰乙酸和50ml 0.5mol/L PH=8.0的EDTA溶液，加水定容至500ml，室温保存。 ③ 溴化乙锭(EB) (10mg/ml) 在20ml水中加入0.2g EB,磁力搅拌，然后用铝箔包裹容器或将溶液移至棕色瓶中，室温保存。
④ RNA电泳 loading buf. (一般为6×)
2. 实验过程
(1) (2)
细胞种板：按相应细胞密度种板及处理，可以参考WB中的相关方法。 mRNA提取：（所有试剂和耗材都需要RNA-free，一般认为氯仿等试剂新开瓶的都是RNA-free的，所以可以作为专属RNA用做好标记）
① 去细胞培养液用预冷的PBS洗1次，一般常用六孔板，每孔加入Trizol 300ul-500 ul,
用RNA-free的枪头,吹打细胞数次,并转移到1.5mlEP管中室温孵育5min（此时的EP管不一定需要RNA-free，可以是普通的EP管，但用于吸取液体的枪头一定要是RNA-free的）。
② 按照每1mlTrizol加入0.2ml氯仿，盖紧样品管盖，用手用力摇15s并将其在室温条件
下孵育2-3min。（可用放doff管的两块板叠加用于剧烈振摇）
③ 在4℃以12000×g的离心力高速离心15min（离心机需要提前预冷）
④ 离心后的3层(下层红色的苯酚-氯仿层，中间为蛋白层，上层为无色水样)，RNA存在
于水样中。将水样层转到新的去RNA酶的EP管中，吸取上清过程中，不要贪多，RNA的量永远是大大足够的，一定要避免吸到中间层。 (3) RNA沉淀
① 向移好的水样层中加入异丙醇，每1mlTrizol加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀。 ② 将混匀的样品在室温条件下孵育10min。
③ 在4℃以12000×g的离心力高速冷冻离心10min(离心前RNA不见，之后形成白色沉淀
附于管底)。 (4) RNA洗涤、干燥及溶解
① 倒去上层悬液，每1ml的Trizol加入1ml 75%EtOH轻弹（也可以不管Trizol量直接都
加1ml）。
② 4℃下以7500×g的离心力冷冻离心5min。倒去上清，再短暂离心一下，目的是使剩余
液体聚集在管底，用200ul RNA-free的枪头小心吸尽剩余液体。干燥RNA，室温下自然挥发10min，一般呈半透明状即可，不能挥发太久，若太干会不好溶解。②加DEPC水30ul溶解RNA沉淀，短暂离心，离心后放在55度烘箱中放置10min,助溶，拿出后用枪吹匀。 (5) RNA浓度的测定
提取得到的RNA取2μl+78μlTE或水中稀释，（吸出RNA用的枪头要用RNA-free的，装稀释液的管子用普通的管子就可以）。混匀后用蛋白核酸测定仪进行测定：先测空白（如稀释液为TE就用TE作空白，水就用水作空白），再依次测定样品。(换测定样品时不需要洗涤样品槽，一般只要将液体弃尽就好，但使用完毕后一定要用蒸馏水清洗)。RNA样品其A260/A280的值一般在1.8-2.2之间，一般2左右最好。
OD×40×稀释倍数
RNA浓度(μg/μl) =
1000
测定结果如下：
若上样RNA的总量为1μg，则需加入的样品的体积数为：v=m/c=1μg/c样品 RNA浓度在1-2ug/ul储存于-80度比较稳定，考虑到反转时候体积一般选择RNA浓度1ug/ul左右为佳。