（ DE3 ）指宿主为 λ DE3 溶原菌，其染色体上带有一拷贝由 lacUV5 启动子控制的 T7 RNA 聚合酶基因。这类菌株适用于从克隆到 pET 载体的目标基因生产蛋白。命名为 pLysS 和 pLysE 的宿主菌带有编码 T7 溶菌酶（为 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物）的 pET 相容性质粒。带有 pLysS 的细胞产生少量溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制 T7 RNA 聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的 pET 重组体。带有 pLacI 的宿主菌产生额外的抑制 pETBlue 和 pTriEx 载体基础表达的 lac 阻遏蛋白。 λ DE3 溶原化试剂盒用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。
AD494 菌株为硫氧还蛋白还原酶 ( trxB ) 突变菌株，能够在胞浆内形成二硫键，提供了生产正确折迭的活性蛋白的潜力。 TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的质粒。
B834 为 BL21 的亲本菌株。这些蛋白酶缺陷宿主菌为甲硫氨酸营养缺陷型，可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记，从而用于结晶学研究。
BL21 应用最广的宿主菌来源，具有 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷的优点。
BL21 TrxB 菌株在蛋白酶缺陷 BL21 背景上具有与 AD494 菌株相同的硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 。由于 trxB 宿主有利于胞浆内二硫键形成，它们的使用可增加正确折迭的蛋白组分。 TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的质粒。
BLR 为 BL21 的 recA - 衍生菌株，能够改善质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列或其产物能够引起 DE3 噬菌体丢失的目标质粒。
HMS174 菌株在 K-12 背景上提供了 recA 突变。与 BLR 一样，这些菌株能够稳定其产物能够引起 DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。
NovaBlue 适合 用作初始克隆宿主菌的 K-12 菌株，具有高转化效率、蓝 / 白斑筛选能力（与合适质粒）和导致优质质粒 DNA 高产的 recA endA 突变。由于存在 F 附加体编码的 lacI q 阻遏蛋白， NovaBlue 的 DE3 溶原菌是一个非常有用的严紧型宿主菌。
Origami 为 K-12 衍生的宿主菌，硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 和谷胱甘肽还原酶 ( gor ) 基因均为突变，能够大大增强胞浆内二硫键的形成。研究表明即使总体表达水平相似， Origami （ DE3 ）表达的活性蛋白比其它宿主菌高 10 倍以上。 Origami 宿主菌与氨苄抗性质粒相容，可用于 pET-32 载体，硫氧还蛋白标签能够进一步增强在胞浆内形成二硫键。 TrxB 和 gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的 pET 质粒。
Origami B 宿主菌来源于 BL21 lacZY 突变株，还带有与原始 Origami 菌株相同的 TrxB / gor 突变。 Origami B 菌株集 BL21 、 Tuner 和 Origami 宿主菌的优点于一体。 TrxB 和 gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的 pET 质粒。
Rosetta 宿主菌从 BL21 衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子 AUA 、 AGG 、 AGA 、 CUA 、 CCC 和 GGA 的 tRNAs 。这样 Rosetta 菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。 tRNA 基因由它们的天然启动子驱动。在 Rosetta （ DE3 ） pLysS 和 Rosetta （ DE3 ） pLacI 中，稀有 tRNA 基因存在于分别带有 T7 溶菌酶和 lac 阻遏基因的同一质粒上。
Tuner 菌株为 BL21 的 lacZY 缺失突变株，能够调整培养物中所有细胞的蛋白表达水平。 lac 通透酶（ lacY ）突变使得 IPTG 均匀进入群体所有细胞，从而具有浓度依赖、水平均一的诱导表达。通过调整 IPTG 浓度，表达可从极低水平调节到极强、完全诱导的表达水平（通常与 pET 载体相关）。低水平表达有时可能增强难表达蛋白的溶解性和活性。 Tuner （ DE3 ） pLacI 菌株与 pETBlue 和 pTriEx 载体的表达相容。
建议兄弟首先学习本版以前的帖子。
搬出老帖子，我们共同学习一下：
eeflying ：原核表达系统中，哪种载体最好 ？ 原核表达没有最好，可以说一般都是在碰，
和你要表达蛋白的性质有关，也和你表达后的用途，及因此而选择的表达策略有关。 比如，
１。你是否介意有亲和标签，亲和纯化当然纯化相对容易，但有时亲和标签的存在会影响蛋白的功能， ２。如果用亲和标签，用什么亲和纯化策略，his 或GSH还是染料抑或是IgG-ProteinA亲和，LAB的
IMPAC-TWIN,还是别的如转铁蛋白等，亲和层析的策略也有很多，
３。最终产物是否有必要将亲和标签去掉，如用蛋白酶切掉标签，或 IMPAC-TWIN会自己切掉，用因子X切掉HIS,
4。表达的部位，是可溶性表达还是包涵体表达，是周质表达还是分泌表达还是分泌表达。 ５。是否加入开关诱导、或是加入IPTG诱导噬菌体T7系统。 ６。你表达的蛋白质是否会与细菌内某些蛋白相互作用而致表达失败。 ７。如果不用亲和标签，纯化用什么方法纯化？
８。即使都考虑全了，表达也未必成功，换载体是很常见的是。
９。载体选好后，表达条件的优化，如培养温度，培养时间，IPTG浓度 等，我们一般在这部用正交设计或析因设计决定。
１０。蛋白纯化条件的优化，用均匀设计或球面设计或正交设计作曲线拟合，通过导数求极值的方法优化蛋白纯化条件。
这些问题是相互关联的，在实践中可得有一段时间去摸索了。
YONG:原核表达系统中，哪种载体最好 ？ 载体没有最好，看哪一种最合适你的实验目的。 这几年新发展的载体一般具有下列特点的一个或多个： 1）更多的融合标签选择（提供多种亲和纯化方便） 2）严紧的表达调控，更低的渗漏表达 3）分子伴侣蛋白，促进折叠和可溶性表达
此外，具有更好的质粒稳定性并能够纠正遗传密码偏爱的新的蛋白酶缺陷的宿主细胞也是一个很好的工具。 最新的不一定是最好的，pBV220经常可以给出不错的表达，虽然多半是包含体。
YONG:关于表达载体
不同的载体的特点不同，主要的差别有启动子类型，质粒拷贝数等，基因本身的因素基因5’非编码区的二极结构，密码子的偏爱性等，宿主菌的特点也很重要（BL21是蛋白酶缺陷的菌株），融合表达策略也有利于顺利表达外源蛋白。这些就决定了对某一个特定的基因而言，并非所有的表达载体都适合。现在还没有谁可以用大肠杆菌成功表达每一个基因，尤其是使用指定的表达系统更是不可能。根据研究的目的以及基因和载体的特点选择表达系统，说说容易，做起来很难。
SDS-PAGE所显示的不表达很多情况下是低表达，尤其是当目的蛋白迁移率与菌体中某种丰富蛋白一致时，不高的表达带常被遮盖。Western blotting的灵敏度高，可以用来检测很低的表达。
对于某些研究来说，表达是为了在细胞内提供某种功能，不需要高表达；更多的情况是把大肠杆菌作为制备重组蛋白的细胞工厂，此时表达量具有重要意义，低表达为蛋白纯化带来困难，对于某些研究或开发来说，低表达意义不大。 当然，通过western blotting检测可以排除一些基因表达中的不确定或待确定因素，而且某些时候即使是高表达，western blotting也是蛋白定性的重要指标。
YONG:请教-pET表达 我试着说一下：
1）如何获得非融合高效表达？
高效的非融合表达很多情况下是大肠杆菌表达最愿意看到的结果，如果是可溶性的，可能会让大部分研究者更加兴奋。但理想和现实是有差距的。凭心而论，你做的还是不错的，毕竟看到了高效表达，虽然是包
含体，虽然信号肽的切割情况不明，毕竟你可以拿到东西了。可以试一下包含体的复性和纯化，测测活吧！否定一个信心苦苦得出的结果要慎重呀！ 下面讨论一下如何实现更高的追求：
首先是老生长谈，影响大肠杆菌表达的因素：
遗传密码偏爱性、mRNA5'二级结构、第二密码子等，参见各种综述和论坛中的帖子。
融合表达优化了上述影响表达的因素，所以更容易成功。很多药用蛋白的表达也采用了融合表达策略，可能是无奈的选择，也可能是为了获得可溶性表达或为了获得有利于初步纯化的性质并成功的解决了酶切或化学切割融合头后目的蛋白的纯化。IL-11就是这样的例子。所以非融合表达并不是一无是处，关键看有没有办法达到最后的目的。如果是药用蛋白，准备申报临床，最好保持天然的N-末端，所以蛋白酶或化学切割要非常特异，不要再N端引入新的氨基酸或导致目的蛋白N端不整齐。
非融合表达的N端的Met一般是报批容许的，虽然这不是天然的形式。非融合表达省略了切割融合头的步骤和切割后的纯化步骤，具有成本优势。非融合表达的实现首先需要分析，其次看运气，有时运气因素更多。尽可能把影响基因表达的因素都考虑到并逐个优化要花费很大的精力，但这并不能保证这种优化一定会得到理想的结果，未知的因素和因素之间的作用使得完美的优化方案非常难实现，而且基因本身的因素也不允许随心所欲的优化（比如氨基酸序列不能任意改变）。原核表达的特点就是时间短、花钱少，所以多方案的尝试和理性的分析结合是大多数研究者采用的基本策略。具体到你的实验来说，如果你是要做药用蛋白，在融合表达成功后可以a.纯化一点蛋白，看看N-末端；b.在你的融合头后面引入一个切割位点，切割后产生天然N-末端。选择策略看你们实验室的传统，怎么方便怎么做。有的实验室纯化能力强，有得上游强。不管如何，建立有效的测活方法很关键，这可以为表达策略和纯化策略提供指引。
至于可溶性表达，看情况吧！如果你的包含体复性很成功，不必强求可溶性。降低诱导温度，降低菌生长速度和基因表达速度，降低总表达量，把蛋白导入周质空间和使用具有分子伴侣功能的融合等策略有助于实现可溶性表达，但都没有把握。如果你的蛋白的二硫键非常多，可溶性表达难度会较大。这些一般的原则很多综述或研究论文都有不同角度的表述，关键是结合自己的研究目的和实验室的条件灵活运用。 2）基因往表达载体中克隆失败。可能是克隆的操作问题，也可能是这种表达方式导致的表达对细胞生长有不利影响或重组后的质粒不稳定。
验证克隆操作可以通过载体自连对照解决，如果载体自连后的转化子没有或很少，说明酶切操作没有问题。 如果表达产物对细胞有毒或质粒不稳定就不容易解决了，也许凭经验可以判断原因，但更换载体、宿主或表达方式可能是最常用的方法。
YONG:浅论基因表达系统的选择
因表达是基因工程的重要内容，是工业、医疗和基础研究领域的重要技术。
基因表达系统按照基因表达宿主的性质分为原核表达系统和真核表达系统两类，前者主要包括大肠杆菌表达系统和枯草杆菌表达系统等，后者主要包括酵母表达系统、丝状真菌表达系统和哺乳动物细胞表达系统等。
原核表达系统以大肠杆菌表达系统为代表，具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点，缺点主要是蛋白质翻译后加工机制的缺乏，如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠。 简单单细胞真核生物表达系统以酵母表达系统为代表，其中甲醇酵母具有较大优势（主要包括毕赤酵母Pichia pastoris和汉森酵母Hansenula ploymorpha）。甲醇酵母表达系统主要优点有：表达量高，表达可诱导，糖基化机制接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化，容易实现高密发酵等。缺点是并非所有基因都可以获得高表达，当然，这是几乎所有表达系统的共同问题。
哺乳动物细胞表达系统主要优点是蛋白翻译后加工机制最接近体内的天然形式，缺点是表达量通常较低，生产成本高。
表达系统选择的根据是研究和开发的目的。具体考虑以下几个方面：
目的基因的来源，如果是大肠杆菌来源的基因，选择大肠杆菌作为表达系统较好，这主要是考虑到与目的
基因来源相同的宿主对于保证蛋白的活性较有利且基因遗传密码的偏爱性较一致。
生产的成本和工艺放大要求。大肠杆菌和毕赤酵母系统生产重组蛋白的成本低，生产工艺较简单，用于规模化生产较有利。如果是研究需要小量蛋白，主要考虑目的蛋白的活性和小规模纯化制备的方便。 研究周期和可操作性。在这一点上，大肠杆菌优于酵母，酵母优于细胞。
蛋白的用途和用量。对于药品开发，这三种宿主都可以选择，但要考虑到报批的要求。如果是体内用，天然的氨基酸序列较重要，最好不要因为基因表达和蛋白纯化的便利引入融合伴侣，如果是制备抗原用于纯化和体外的活性研究则不必太严格。某些蛋白体内活性需要的剂量并不大，如angiostatin，但是，大肠杆菌或酵母表达的蛋白体内半衰期短，所以蛋白用量较大。
蛋白的天然性质。如果目的蛋白本身是分泌蛋白，则选择分泌表达较好，毕赤酵母分泌表达优势非常显著。对于大肠杆菌系统来说，其蛋白的分泌机制复杂，除了信号肽之外，有些蛋白的分泌和与成熟蛋白的序列有关，而且大肠杆菌的分泌很难进入培养基，通常是在周质空间积累。根据蛋白活性的要求，结合其天然的性质，选择表达系统是非常重要的。
知识产权的考虑。如果是研究工作，选择商品化的载体较好，因为同行对这些载体也很了解，对于用这些载体做出来的结果容易比较。如果是开发工作，选择表达系统时最好是把载体的知识产权问题考虑进去，否则可能会受制于人。
总之，选择一种合适的表达系统是开始基因表达工作前的重要步骤，选择的主要依据是研究的目的，结合各种其他参数的综合考虑。这种选择可以充分体现出研究者智慧和风格。
YONG:寻找载体 1）pThioHisA,B,C
Trc 启动子，Thioredoxin融合，IPTG诱导，也可以用NdeI进行非融合表达 www.invitrogen.com 2）pBV220
PLPR***启动子，42度热诱导，EcoRI克隆，非融合表达。 病毒所张智清、候云德等构建，国内很多实验室有。 3）pET系列
T7启动子，IPTG诱导，一般为融合表达，NdeI或NcoI非融合表达 www.novagen.com 4）pQE系列载体
T5启动子,IPTG诱导，融合表达 www.qiagen.com
原核表达载体种类非常多，下表不一定全 Features of E.coli Expression Vectors
Vector Name Promoter Selection marker Tag or Fusion Partener Protease Cleavage Replicon Provider pALTER-Ex1 T7 Tet none none Promega pALTER-Ex2 T7 Tet none none Promega
pBAD/His araBAD Amp N-His EK pUC Invitrogen pBAD/Myc-His araBAD Amp C-His none pUC Invitrogen pBAD/gIII araBAD Amp C-His none ColE1 Invitrogen pCal-n T7-lac Amp N-CBP Thr ColE1 Stratagene pCal-n-EK T7-lac Amp N-CBP Thr，EK ColE1 Stratagene pCal-c T7-lac Amp C-CBP Thr ColE1 Stratagene pCal-Kc T7-lac Amp C-CBP Thr ColE1 Stratagene pcDNA 2.1 T7 Amp none none pUC Invitrogen