防己中粉防己甲素和乙素的提取分离与鉴定
[适用对象] 环境科学、药学、药物制剂专业 [实验学时] 24学时
一、实验目的
学习生物碱类成分的一般提取分离法，通过实验要求： （1）掌握生物碱的溶剂提取法和粉防己碱与防己诺林碱的分离方法。
（2）熟悉生物碱的一般理化性质。
（3）熟悉粉防己碱和防己诺林碱的检识方法。
（4）掌握回流法、萃取法、结晶法等的基本操作过程及注意事项。
二、实验原理
本实验是根据粉防已碱和防已诺林碱游离时难溶于水，易溶于氯仿，成盐后易溶于水，难溶于氯仿的性质提取得到总生物碱。再利用两者在冷苯中的溶解度不同，使之相互分离。
三、仪器设备
（单口，双口）园底烧瓶，冷凝管，铁架台，分液漏斗，三角烧瓶，滤纸，微量抽滤器，布氏漏斗，层析槽，毛细管等。
四、相关知识点
防已为防已科植物粉防已Stephania tetrandra S.Moore的干燥根。总生物碱含量约为1.5~2.3%，主要为粉防已碱和防已诺林碱。
1、粉防已碱（tetrandrine），又称汉防已甲素，分子式C38 H42 N2
O6，在防已中的含量约为1%，为无色针状结晶（乙醚），mp.217~218℃。易溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿，溶于乙醚、苯等有机溶剂，几乎不
溶于水和石油醚。
OMeH3CNMeONOOOMe粉 防 已碱 R=CH3防 已诺 林碱 R=HCH3OR
2、防已诺林碱（fangchinoline），又称汉防已乙素，分子式C37 H40
N2 O6，在防已中的含量约为0.5%，六面体粒状结晶（丙酮），mp.237~238℃。溶解度与粉防已碱相似，但因较粉防已碱多一个酚羟基，故极性较粉防已碱稍大，因此在冷苯中的溶解度小于粉防已碱，可利用此性质相互分离。
五、实验步骤
（一）总生物碱的提取
称取粉防已粗粉150克，置1000 ml圆底烧瓶中，加 95%乙醇以浸透并盖没生药为度（约需400 ml）。水浴加热回流1小时（加热期间振摇数次），滤出提取液，药渣再加95%乙醇以浸没为度（约需300 ml），如上法再热提一次，滤出提取液，最后将瓶内药渣倒在布氏漏斗上抽滤压干，药渣弃去。合并两次乙醇提取液，放冷后如有絮状物析出，再抽滤一次，澄清液回收乙醇，浓缩至糖浆状无乙醇味为止，得乙醇总提取物。 （二）生物碱的分离
1、亲脂性生物碱和亲水性生物碱的分离
糖浆状总提取物移至大三角烧瓶中，逐渐加入1 %盐酸稀释，充
分搅拌使生物碱溶解，不溶物呈树脂状析出，直至加酸水溶液不再发生混浊为止（约需300 ml），静置，倾出上清液，瓶底的树脂状杂质以1 %盐酸少量分次洗涤，直至洗液对生物碱沉淀试剂反应微弱时为止。
合并洗液和滤液，静置片刻，抽滤得澄清滤液，置1000 ml三角烧瓶中，滴加浓氨水至PH 9左右，此时亲脂性叔胺碱游离析出（如有发热现象，设法冷却），待溶液冷后，移至1000 ml的分液漏斗中，加氯仿150 ml振摇萃取。分取氯仿层，氨碱性水溶液再以新鲜氯仿萃取数次，每次用氯仿 100 ml，直至氯仿抽提液的生物碱反应微弱时止（检查时取少量氯仿抽提液置表面皿上，待溶剂挥干，残留物中加稀盐酸数滴使溶解，再加生物碱沉淀试剂试之），合并氯仿液。
此氯仿液中含亲脂性叔胺碱，氯仿萃取过的氨碱性水溶液含亲水性季铵碱。后者取出少量，加盐酸酸化至PH 4~5，滴加雷氏铵盐饱和水溶液，观察有无沉淀出现。 2、亲脂性碱中酚性和非酚性碱的分离
氯仿萃取液合并约（300~ 400 ml）移至1000 ml的分液漏斗中，以 2 %氢氧化钠水溶液 40 ml 一次，萃取 2 次，氯仿液再用水 20 ml 一次，洗涤 2 次。分取氯仿层，加无水碳酸钾脱水干燥，过滤，滤液常压下回收氯仿。将氯仿全部蒸去，残留溶剂去瓶塞后挥干，得粗总非酚性生物碱。
2 %氢氧化钠提取液合并后取出少量，加盐酸酸化后进行生物碱反应。
附注：防已诺林碱虽有酚羟基但不溶于氢氧化钠水溶液中因而和非酚性生物碱一起在氯仿层中。 3、叔胺生物碱的纯化
在盛有非酚性生物碱的圆底烧瓶中，加丙酮加热溶解，过滤，用热丙酮洗涤滤纸，滤液、洗液合并，回收丙酮至适量，放冷，加塞静置待结晶析出。析出完全后抽滤收集。母液再浓缩重复处理，尚可得结晶。合并数次结晶即为粉防已碱和防已诺林碱的混合物。 4、粉防已碱和防已诺林碱的分离
苯冷浸法：取上述结晶状混合物碱称重，置于50 ml三角瓶中，加5倍量的苯冷浸，时时振摇，冷浸半小时后，过滤分开苯溶液和苯不溶物。
苯溶液回收苯至尽，残留物以丙酮重结晶，得细针状结晶，为粉防已碱。
苯不溶物待挥发去残留的苯后，也用丙酮重结晶，可得粒状结晶，为防已诺林碱。
（三）生物碱的一般鉴定方法 1、沉淀反应
（1）碘化汞钾试验：取样品的稀酸水溶液1 ml，加碘化汞钾试剂（Mayer氏试剂）1~2滴，出现白色或类白色沉淀者为阳性反应，表示有生物碱存在。
（2）碘化铋钾试验：取样品的稀酸水溶液1 ml，加碘化铋钾试剂（Dragendorff氏试剂）1~2滴，出现棕黄至棕红色沉淀者为阳性反应，
表示有生物碱存在。
（3）碘-碘化钾试验：取样品的稀酸水溶液1 ml，加碘-碘化钾试剂（Wangner氏试剂）1~2滴，生成褐色至暗褐色沉淀者为阳性反应，表示有生物碱存在。
（4）雷氏铵盐试验：取样品的稀酸水溶液（PH 4~5）1 ml，加雷氏铵盐试剂数滴，生成黄红色沉淀者为阳性反应，表示有生物碱存在。 （5）苦味酸试验：取样品的中性溶液1 ml，加苦味酸的饱和水溶液1~2滴，生成黄色沉淀者为阳性反应，表示有生物碱存在。 2、薄层色谱
吸附剂：中性氧化铝（Ⅲ级）干法制板 样品：（1）粉防已碱 （2）防已诺林碱
（3）总提取物（均以氯仿溶解） 展开剂：氯仿-丙酮-苯（3﹕1﹕4）
显色剂：喷以改良碘化铋钾试剂（干法铺板显色时，要在溶剂未干前喷显色剂，否则氧化铝粉末易飞散，使薄层破坏）。 （四）实验流程
酸水液 置于分液漏斗中，加氨水调PH值9~10，氯仿振摇萃取
不溶物
浓缩液 加1%盐酸300 ml 充分溶解，静置，抽滤 滤液 回收乙醇至无醇味
药渣（弃去）
防已粗粉150g 95%乙醇加热回流2次（第一次400ml，第二次300 ml），每次1h，过滤 碱水层 氯仿层
六、实验报告要求
应包括原理描述、实验流程、数据记录、解决问题的能力、实验结果、实验效果及建议等。
七、思考题
1、粉防已碱、防已诺林碱在结构与性质上有何异同点？实验过程中，应怎样利用它们的共性及个性进行提取分离？请设计方案。
2、分离水溶性与脂溶性生物碱的常用方法有哪些？
3、从防已中分离脂溶性、水溶性碱，酚性、非酚性碱的依据是什么？
4、萃取过程中怎样防止和消除乳化？
5、生物碱的沉淀反应应在什么条件下进行，为什么？
八、实验成绩评定方法
本门实验课程考核成绩占课程总成绩的30％，该实验考核成绩占实验总成绩的40％。考核分实验预习、实验过程操作、实验报告等三个方面，成绩计算为预习实验占20%（包括原理描述、实验流程）、实验过程操作占40％（包括数据记录、解决问题的能力）、实验报告占40％（包括实验结果、实验效果）。