探究点三 PCR扩增技术 1．简述PCR原理。
2．补充完整PCR的反应过程
(1)________：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，如下图：
(2)________：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：
(3)________：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A，T，C，G)在________________的作用下，根据________________原则合成新的DNA链，如下图： 思维拓展
1．DNA复制需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。
2．PCR结果：(1)PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。(2)两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。
3．细胞内DNA复制与PCR技术的比较 细胞内DNA复制 PCR 不 解旋 在解旋酶的作用下边解旋边复制 80℃～100℃高温解旋，双链完全分开 同 酶 DNA解旋酶、DNA聚合酶 TaqDNA聚合酶 点 引物 RNA DNA或RNA 温度 体内温和条件 高温 相 同 ①需提供DNA复制的模板；②四种脱氧核苷酸作原料；③子链延伸的方向都是从5′端点 到3′端 探究示例3 近十年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。
(1)加热使DNA双链打开，这一步是打开________键，称为________，细胞中是在________的作用下使此键断裂的。
(2)当温度降低时，引物与模板______端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最终合成2个DNA分子，此过程中原料是________，遵循的原则是______________。
(3)PCR技术的必要条件，除了模板、原料、ATP、酶以外，至少还需要三个条件，即：液体环境、适宜的________和________。
(4)下图为某一次循环的产物，请据图回答问题。
①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为________、________、________三个步骤。
②DNA的羟基(—OH)末端称为________，图中所示的羟基端为________。(填字母) ③以引物为标记，可判断出此产物最早为第________次循环的产物。 探究点三
1．PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供：DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
2．(1)变性 (2)复性 (3)延伸 DNA聚合酶 碱基互补配对
探究示例3 (1)氢 解旋 解旋酶 (2)3′ 四种脱氧核苷酸 碱基互补配对原则 (3)温度 酸碱度 (4)①变性 复性 延伸 ②3′端 A、D ③一 解析 (1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链间的氢键断裂，称为解旋，而细胞中是在解旋酶的作用下使氢键断裂。(2)PCR技术扩增DNA与细胞内DNA复制所需原料一样，为四种脱氧核苷酸，遵循的原则是碱基互补配对原则。引物与模板的3′端结合后，DNA聚合酶才发挥作用。(3)PCR技术与体内DNA复制不完全相同，除了需要模板、原料、ATP、酶以外，至少还需要液体环境(稳定的缓冲液环境)，每一步骤需要适宜的温度及酸碱度。(4)①PCR的每一轮循环包括变性、复性和延伸三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也作为模板参与反应。②DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(—OH)末端称为3′端，而磷酸基团的末端称为5′端。DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。因此DNA复制需要引物，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。由另一条新合成的DNA可知，A端为3′端，B端为5′端，D端为3′端。③在PCR反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物Ⅰ和引物Ⅱ与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的每个子DNA中只有一种引物；从第二次循环开始，上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，所以会出现DNA分子两端均含引物的情况，如图所示：
因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。 考点三 生物科技新手段——PCR扩增技术
1．原理：DNA复制。
2．条件：模板、原料、酶、ATP。 3．场所：体外PCR扩增仪。
4．方向：DNA复制的具体过程涉及DNA双链的方向。DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(—OH)末端称为3′端，两个磷酸基团的末端称为5′端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 5．过程
(1)变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋为单链，如下图：
(2)复性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：
(3)延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：
7．PCR技术的应用
PCR技术模拟细胞内DNA的复制过程，实现对某一段DNA的扩增。PCR技术能在几小时内将极微量的DNA特异性地扩增上百万倍，从而有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的难题，大大提高了对DNA分子的分析和检测能力，被广泛地应用于基因克隆、基因序列分析、遗传病诊断、古生物学研究以及刑侦破案、亲子鉴定等诸多方面。
3．多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。请回答下列有关PCR技术的基本原理及应用问题。
(1)DNA的两条链是反向平行的，通常将________的末端称为5′端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的________开始延伸DNA链。 (2)PCR利用DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到______________，它的发现和应用解决了上述问题。要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫______________。
(3)PCR的每次循环可以分为__________________三步。假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约有____个这样的DNA片段。 (4)请用简图表示出一个DNA片段PCR反应中第二轮的产物。
(5)简述PCR技术的主要应用。_______________________________________
33．2011年高考（8分）请回答基因工程方面的有关问题：
(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。 图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。
①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 ▲ 。 ②在第 ▲ 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。
(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。
①第1组： ▲ ； ②第2组： ▲ 。
(3) PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的 功能，这是因为 ▲ 。
(4)用限制酶EcoRV、Mbol单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图(1 kb 即1000个碱基对)，请在答题卡的指定位置画出质粒上EcoRV、Mbol的切割位点。
【解析】：本人感觉这题很那个??2011版考试说明明确删除了PCR这一考点，但整个考题从头到尾都是考查PCR的，不知道高考命题组是否学习了考试说明？
①下图为人教版教材中的插图，查图可知，第二轮中含引物II（或考题中的引物A）比例为3/4，第三轮中占7/8，即所有DNA片段中，只有一个片段不含引物II，故推测在第四轮中，含引物II（或引物A）的比例为15/16。
②由于题图中的引物A和引物B均不在该片段的端点，因此第一轮循环后，得到的两DNA片段中两条脱氧核苷酸链都不等长，通过自行绘图可推知，第二轮中亦不会出现等长的，需到第三轮（试试看吧，这就不画出了）。
(2)这一
问，对考生而言，完全不知从何说起，因为没有哪个版本的高中生物教材有关于引物选择方面的介绍，唯高校网络资源中有不多的介绍：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：
1、引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
2、引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 4、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
5、引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
6、引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
如果能了解上述信息，或许可以分析题图中的碱基组成，查出如下不合理之处：