）ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｓｏｆｔｗａｒｅｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｓｅｑｕｅｎｃｅＢｉｏｓｏｆｔ
［９］
ａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｔｒｅｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＲＮＡｉｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｆｒａｇｍｅｎｔｓ ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄＲＮＡ２ｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓａｎａｌｙｚｅｄａｎｄｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｒｅｇｉｏｎｓｉｎｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｏｄｅｓｉｇｎａｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｐｒｉｍ?，ａｎｄｔｈｅｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｐｒｅｓｅｒｖｅｄｏｎｔｈｅＴ?ｖｅｃｔｏｒｗａｓｅｒｓｕｓｅｄａｓａｔｅｍｐｌａｔｅ，ｔｈｅｔｗｏｐａｉｒｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓＣＲ２?Ｋｐ／ＣＲ２?ＳＢａｎｄＣＲ２?Ｂｇ／ＣＲ２?ＳＢｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｍｐｌｉｆｙｔｈｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ＆ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．１１，Ｎｏ．５，２０１０
ａｃｉｄｈｏｍｏｌｏｇｙｗａｓｏｆ７１．３％－９８．８％ａｎｄ７４．０％－９８．５％
（Ｔａｂｌｅ３），ｉｎｗｈｉｃｈｔｈｅＮＳ０４ｉｓｏｌａｔｅｈａｄｈｉｇｈｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈＰｈｙｌｉｎｅｓｗｈｉｃｈｗａｓｆｒｏｍＺｈｅｊｉａｎｇｏｆＣｈｉｎａ，ｔｈｅＧｅｎｂａｎｋｎｕｍｂｅｒｗａｓＤＱ４１２７３１（Ｆｉｇ．２），ｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄａｍｉｎ
ｏ
ｆｒａｇｍｅｎｔＰＣＲ＿ＣＲ２＿ＢＫａｎｄＰＣＲ＿ＣＲ２＿ＳＢ．ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐＢｉ３５ＳＣＲ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ ＡｆｔｅｒｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｅｄＰＣＲ＿ＣＲ２＿ＢＫｗａｓｒｅｃｏｖｅｒｅｄｗｉｔｈＢａｍＨⅠａｎｄＫｐｎⅠｄ
ｉｇｅｓｔｉｏｎ，ｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｄｉｇｅｓｔｅｄｐｉＲＤＧ１２ｓｉｔｅｓｗｅｒｅｉｎｓｅｒｔｅｄ
，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｐｉＲＤ＿ＣＲ２．Ｓｆｉｒｓｔｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｖｅｃｔｏｒｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ（Ｆｉｇ．１Ａ）．ＴｈｅａｍｐｌｉｆｉｅｄＰＣＲ＿ＣＲ２＿ＳＢｗａｓｒｅｃｏｖｅｒｅｄｗｉｔｈＢｇｌⅡａｎｄＳａｃⅠｄ
ｉｇｅｓｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅｃｏｒｒｅ?ｓｐｏｎｄｉｎｇｄｉｇｅｓｔｅｄｐｉＲＤ＿ＣＲ２．Ｓｓｉｔｅｓｗｅｒｅｉｎｓｅｒｔｅｄ
，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｐｉＲＤ＿ＣＲ２ｓｅｃｏｎｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｖｅｃｔｏｒｗａｓｇａｉｎｅｄ（Ｆｉｇ．１Ｂ）．ＡｆｔｅｒｔｈｅｐｉＲＤ＿ＣＲ２ｖｅｃｔｏｒｗａｓｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈＸｂａⅠａｎｄＥｃｏＲⅠ，ｔｈｅｓｍａｌｌｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ?ｉｎｇｓｉｔｅｓｏｆｄｉｇｅｓｔｅｄｐＢｉ３５ＳＧ１２，ａｎｄｆｉｎａｌｌｙｔｈｅｐＢｉ３５ＳＣＲ２
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ（
Ｆｉｇ．１Ｃ），ｔｈｅｄｅｓｉｇｎｏｆｖｅｃ?ｔｏｒｗａｓｃｏｍｐｌｅｔｅｄｗｉｔｈＶｅｃｔｏｒＮＴＩａｓｓｉｓｔ
．
Ｆｉｇ．１ ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐｉＲＤ?ＣＲ２．Ｓ（Ａ），ｐｉＲＤ?ＣＲ２（Ｂ）ａｎｄ
ｐＢｉ３５ＳＣＲ２
（Ｃ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒＧｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｔｏｔｏｂａｃｃｏ Ｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ
ｐＢｉ３５ＳＣＲ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＡｇｒｏｂａｃ?ｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＧＶ３１０１，ｔｈｅＮｉｃｏｔｉａｎａｔｏｂａｃｃｏ（Ｎｔ）ｌｅａｖ?ｅｓｗｅｒｅｃｕｔｉｎｔｏ１ｃｍｏｆｌｅａｆｄｉｓｃ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｔｈｅｎｍｉｘｅｄｗｉｔｈＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆｅｃｔｉｏｎｌｉｑｕｉｄｆｏｒ５－１０ｍｉｎｏｆｓｏａｋｉｎｇ，ｔｈｅ
ｅｘｃｅｓｓｂａｃｔｅｒｉａｌｉｑｕｉｄｗａｓｒｅｍｏｖｅｄａｎｄｄｒｉｅｄ，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｙｗｅｒｅｐｌａｃｅｄｏｎｔｈｅｃｏ?ｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ（
ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌｏｆ６?ＢＡ），ａｆｔｅｒｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｉｎｄａｒｋｆｏｒ１－３ｄ，ｔｈｅｙｗｅｒｅｔｒａｎｓ?
ｆｅｒｒｅｄｔｏｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ（
ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌｏｆ６?ＢＡ＋５０．０ｍｇ／Ｌｏｆ
Ｋａｎ＋３００．０ｍｇ／ＬｏｆＣａｒ）ｆｏｒｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｂｕｄ．Ｗｈｅｎｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｓｈｏｏｔｌｅｎｇｔｈｗａｓａｂｏｕｔ１．５－２．０ｃｍ，ｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｈｏｏｔｗａｓｃｕｔｏｆｆａｎｄ
ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｔｏｒｏｏｔｉｎｇｍｅｄｉｕｍ（
ＭＳ＋０．１ｍｇ／ＬｏｆＩＡＡ＋５０．０ｍｇ／ＬｏｆＫａｎ＋３００．０ｍｇ／ＬｏｆＣａｒ）ｆｏｒｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｒｏｏｔｓ．
ＲｅｓｕｌｔｓａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓ
ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＣＭＶＲＮＡ２ｇｅｎｏｍｅ
ＰｒｉｍｅｒｓＣＭＶ２ＳＰ１／ＣＭＶ２ＡＳＰ２，ＣＭＶ２ＳＰ３／ＣＭＶ２ＡＳＰ４
ｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｍｐｌｉｆｙｔｈｅｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆ１５５３ａｎｄ１３７８ｂｐ
，ａｆ?ｔｅｒｔｈｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｓａｎｄｓｐｌｉｃｉｎｇ，ｐａｒｔｓｏｆＣＭＶＲＮＡ２ｇｅｎｏｍｉｃｆｒａｇｍｅｎｔｗｉｔｈ２８６４ｂｐｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ，ａｎｄｔｈｅｓｅｐａｒｔｓｃｏｎ?ｔａｉｎｅｄｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｅｎｃｏｄｅＣＭＶ２ａ
ｒｅｐｌｉｃａｓｅｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＣＭＶ２ｂｐｒｏｔｅｉｎ
，ｂｙｔｈｅｕｓｅｏｆＤＮＡＭＡＮｓｏｆｔｗａｒｅ，ｔｈｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＣＭＶ２ａｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆＮＳ０４ｉｓｏ?ｌａｔｅａｎｄｏｔｈｅｒｉｓｏｌａｔｅｓ（ＧｅｎｂａｎｋｎｕｍｂｅｒａｎｄｏｒｉｇｉｎｗｅｒｅｓｈｏｗｎｉｎＴａｂｌｅ２）ｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄａｍｉｎｏ