Fig.7Schematicdiagramofnanoparticlesactivation［22］
［22］
作用下，多肽水解，荧光恢复，水解前后传感细胞中的荧光信号发生明显变化，通过检测荧光强度变
。
Caspases-3是细胞凋亡家族信号分子，是凋亡最先启动的酶分子，与癌变等多种疾病密切相关，可
［23］
用于HeLa细胞早期凋亡的研究。以HeLa细胞为研究对象，通过生物素与链霉亲和素间的相互作用3的作用将细胞通透性多肽底物（DEVD）键合在金纳米粒子表面作为活性探针（见图8A），在caspases-下，多肽底物发生水解并从金纳米粒子表面释放（图8B），导致金纳米粒子的等离子散射光发生变化，散射光由红色逐步过渡为黄色，最终变成浅绿色，如图8（C～E）。
酪氨酸蛋白激酶A与细胞凋亡密切相关，同时也是研究最多的激酶之一
［24］
。在聚合阴离子聚丙烯
第11期王锦慧等：
基于纳米粒子的光学细胞传感器在癌细胞研究中的应用1211
酸和聚阳离子聚乙烯亚胺聚合作用下，将一种细胞通透性多肽（GLSARRL，能够识别卵巢癌细胞过量表达的蛋白激酶A）与荧光染料Cy5.5复合为纳米荧光探针，用于观察细胞中蛋白激酶A的磷酸化。荧光染料聚集在纳米粒子中，发生荧光自猝灭，传感细胞几乎不发射荧光；当传感细胞中的蛋白激酶A发生磷酸化时，负电荷的磷酸基团嵌入底物多肽丝氨酸残基中，使纳米粒子解体，荧光染料的荧光迅速恢复，传感细胞中荧光大大增强（如图9）。
该方法可用于单细胞中激酶
［25］
的活性研究。
转移性癌细胞基质中含有高浓度的肝素
［26］
酶，可水解肝素。Lee等采用HeLa细胞中的肝素酶作为分析对象，基于荧光共振能量转移技术，将偶联有荧光染料的肝素固定在金纳米粒子表面，使荧光猝灭；肝素在肝素酶作用下水解，荧光染料从纳米粒子上脱落，染料荧光恢复。同时采用激光扫描共聚焦显微镜对转移性癌细胞进行成像（见图10）。
基质金属蛋白酶（Matrixmetalloproteinas-es，MMPs）是一类锌依赖性多肽内切酶，涉及到某些炎症疾病和癌变。Lee等研究了
2和MMP-9的活性，采用特异癌细胞MMP-性多肽序列将荧光团Cy5.5和猝灭基团
BHQ-3连接，形成序列（Cy5.5－Gly－Pro－Leu－Gly－Val－Arg－Gly－Lys（BHQ-3）
－Gly－Gly），将其键合在聚合物纳米粒子表面，形成细胞传感光学探针（图11A）。探针的荧光信号处于猝灭状态，在基质金属酶的作用下，特异性多肽Pro－Leu－Gly－Val－Arg－Gly发生水解，荧光恢复，图11B为其机理图。采用这种光学细胞传感器可研究鳞2和状癌细胞中及结肠癌小鼠体内MMP-MMP-9的活性。
［27］
“皇冠型”金纳米粒子研究caspase-3酶分子
［23］
活性及其动力学过程示意图
Fig.8Schematicofthecrownnanoparticlestodetectcaspase-3
activityandenzymatickineticsunderinvitroconditions［23］
图8
采用聚合物复合纳米粒子分析细胞中
［25］
酪氨酸蛋白激酶活性的机理图
Fig.9Schematicdiagramofprotein-phosphorylation-responsive
polymericnanoparticlesforimagingproteinkinase
activityinsinglelivingcells［25］
图9
1.3癌细胞中活性氧、pH值的研究
癌细胞中微环境（如活性氧、谷胱甘肽、pH值）的变化，可采用光学细胞传感器进行检测。对于活性氧，光学细胞传感界面的设计要求是：能识别细胞中产生的活性氧，并对其变化作出高灵敏响应；能从时间和空间上分辨出活性氧的产生。传统的活性氧敏感型光学探针存在易氧化、特异性差和灵敏度低等缺点，基于纳米粒子的活性氧光学细胞
肝素功能化的金纳米粒子用于转移
［26］
性癌细胞检测的示意图
Fig.10Schematicillustrationofheparin-immobilizedgold
nanoparticles（AuNP－HHep）formetastatic
cancercelldetection［26］
图10
1212分析测试学报第30卷
传感器在一定程度上克服了这些缺点，显示了较高的灵敏度和特异性，对揭示机体产生活性氧的机理具有潜在的理论价值和应用价值
。
对基质金属蛋白酶敏感的聚合物纳米粒子作用机理示意图（A）及聚合物及
［27］
基质金属蛋白酶敏感型荧光多肽的分子结构式（B）
Fig.11Reactionmechanismofmatrixmetalloproteinases（MMP）-sensitiveNS（A）andchemical
structuresofpolymericnanoparticlesandMMP-sensitivefluorogenicpeptide（B）［27］
图11
Lee等［28］基于活性氧和透明质酸酶能降解透明质酸的原理，采用巯基化寡肽将荧光染料功能化的透明质酸与金纳米粒子键合，利用金纳米粒子猝灭荧光染料的荧光，而透明质酸在活性氧或透明质酸酶作用下降解，荧光染料从金纳米粒子表面游离出，荧光恢复（图12），通过荧光信号的恢复可用于分析活性氧或透明质酸酶。将上述探针用于荧光成像，表明癌细胞中产生了较多的活性氧，通过2种药物（LPS和PMA）刺激癌细胞和正常细胞，实现了活性氧的高灵敏度检测
。
图12
基于功能化金纳米探针的荧光猝灭与恢复检测体外活性氧/透明质酸酶的原理示意图Fig.12schematicillustrationofdetectionsROS/HAdaseinvitrobyquenchingand
dequenchingphenomenaoffuctional-goldnanoprobes
［28］
光学细胞传感器应用于细胞中活性氧的检测常存在自发荧光等背景干扰的问题，影响细胞中活性
氧的检测。采用化学发光分析细胞中的活性氧，能减少背景干扰，显示了较高的准确性和灵敏度。Lim等
［29］
构建了一种对过氧化氢敏感的化学发光型探针（如图13A），其原理是聚合物CPPO与过氧化氢反应的产
物不稳定，释放的大量能量使近红外荧光染料Cy5由基态变为激发态，发射荧光（图13B）。该方法检测过氧
第11期王锦慧等：
基于纳米粒子的光学细胞传感器在癌细胞研究中的应用
－8
1213
化氢的检出限可达10
mol·L－1，低于生理条件
－7
体液中过氧化氢的浓度（10mol/L）。
活性氧及胞内高浓度的谷胱甘肽等巯基化合物共同维持细胞内氧化还原状态的平衡。谷胱甘肽是细胞中含量最多的非蛋白巯基化合物，对维持细胞还原氛围起重要作用。杨培慧采用罗丹明B功能化的金纳米粒子结合荧光共振能量转移，实现了对人肝癌hepG2细等