生物化学实验报告
一、实验目的
1.学习并掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理、各试剂的作用及具体操作步骤； 2.学习并掌握PCR基因扩增的原理及具体操作步骤； 3.学习并掌握紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理及方法； 4.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的操作方法。
二、实验原理
1.质粒DNA的提取——碱裂解法
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH高达12.6的碱性条件下，细菌的线性染色体DNA氢键断裂。其中，双螺旋结构解开而变性；而质粒中超螺旋结构共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，线状染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心与变性蛋白质与细胞碎片缠绕在一起形成沉淀；而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，溶于上
清液。
2.PCR基因扩增
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，可以选择性扩增一段DNA序列。是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA的过程。这种延伸—变性—退火—延伸的循环可以重复多次，使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。具体步骤为：
（1）变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链；
（2）退火：使溶液温度降至50～60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合； （3）延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA 聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸，按5’→3’方向复制出互补DNA。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍。
3.紫外光吸收法定量检测质粒DNA
核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质的最大吸收波长为280nm。核酸分子对紫外光的吸收强度与溶液中核酸的浓度成正比，即光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系。故可通过测定在260nm和280nm的A值的比值（A260/A280），估计核酸的纯度。
4.酶切鉴定
限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内
或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。
5.琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，构成大网孔型凝胶。
不同的琼脂糖浓度对应不同孔径的凝胶，可用于分离、纯化相对分子量不同的DNA分子。
DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。不同DNA分子因其所带的电荷数、相对分子量大小和构象不同，在同一电场中的电泳速度也不同，从而从而分出不同的区带，达到分离的目的。
三、材料与方法： 1.实验材料
（1）质粒DNA的提取—碱裂解法
样品：菌液
试剂：LB培养基（液体、固体）、溶液 P1（S1)、溶液 P2 (S2）、溶液 P3（S3）、去蛋白液 PE（W1)、漂洗液 WB(W2）、洗脱液 EB（Eluent)
仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅、Eppendorf管、吸附柱、1.5ml收集管、离心管
（2）PCR基因扩增
样品：菌液
试剂：2×Premix Taq、引物1-SO100 (10mol/L)、引物2-SO101 (10mol/L)、灭菌的去离子水
仪器：加样枪、0.2mlPCR反应管、台式离心机、基因扩增仪
（3）紫外光吸收法定量检测质粒DNA
样品：提取的质粒DNA溶液 试剂：灭菌的去离子水
仪器：紫外分光光度计、UVette比色皿、1.5mlEP管、加样枪
（4）酶切鉴定
样品：菌液
试剂：灭菌的去离子水、10×R+BSA酶切缓冲液、质粒DNA、Hind III(15U/ul)、EcoR I(12U/ul)
仪器：0.2ml收集管、加样枪、台式离心机
（5）琼脂糖凝胶电泳
样品：质粒DNA溶液、PCR产物、酶切产物
试剂：6×loading buffer、电泳缓冲液、DNA Marker5000
仪器：加样枪、凝胶成像分析系统、电泳仪、水平电泳槽、紫外透射仪
2.实验流程
（1）质粒DNA的提取—碱裂解法 向菌液中加入250 μl 溶液S1，吹打， 使细菌沉淀分散， 彻底悬浮； 将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心3min，弃滤液； 加入500μl去蛋白液(W1)，13000rpm离心1min，弃滤液； 向吸附柱中加入700μl 漂洗液W2， 13000rpm离心1min ，弃滤液； 加入250μl 溶液S2，颠倒4-6次温和混匀，直到溶液变得清亮； 加入350μl 溶液S3，立即温和混匀6-8次。13000rpm离心10min，小心取上清液（700μl ）； 再次向吸附柱中加 入700μl 漂洗液 W2， 13000rpm离 心1min ，弃滤液；
（2）PCR基因扩增
空柱13000rpm离心1min，然后开盖室温放置3min，使残留乙醇挥发； 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中心上方垂直悬空加50μl洗脱缓冲液(Eluent)，室温放置1min
13000rpm离心1min洗脱质粒DNA， 保留备用。
菌液煮沸10min, 冷冻，室温解冻后离心取上清； 取0.2mlPCR反应管一只，用微量加样枪加入4.5μl灭菌去离子水； 加入12.5μl 2×Premix Taq； 加入1.5μl引1-SO100 (10mol/L)； 物加入1.5μl引物2-SO101 (10mol/L)； 加入5μl菌液； 将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心； 将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上。
（3）紫外光吸收法定量检测质粒DNA 打开紫外分光光度计，在 UVette比色皿中加入98μ l灭菌的去离子水，调零；
重复上一步骤2次，测量并记录数据。取2μl质粒DNA溶液，加入UVette比色皿中，并与98μl灭菌的去离子水充分混合，测量并记录数据；
（4）酶切鉴定
加入1.0μlHind III (15U/ul) 加入1.0μlEcoR I (12U/ul) 取0.2mlPCR反应管一只，用微量加样枪加入9.0μl去离子的无菌水； 加入2.0ml 10×R+BSA酶切缓冲液； 加入7.0μl质粒DNA； 混合均匀后，37℃ 水浴1.5h。