在逆境条件下（旱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显著增加，植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。 二、原理
磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。 三、试剂
1.2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol·L磷酸（37.7ml磷酸加入水定容至100ml）（浓度为85%的磷酸大约是14mol/l,如果要配置6M的磷酸大约稀释到原来体积的2.3倍即可）中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中，此液在4℃下2-3d有效。
2.3％磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。
3.10μg·ml-1脯氨酸标准母液配制：精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100μg·ml脯氨酸母液），再吸取该溶液10ml, 加蒸馏水稀释定容至100ml, 即为10μg·ml脯氨酸标准液。 4.冰醋酸。 5.甲苯。 四、实验步骤
1. 脯氨酸标准曲线的制作
1.1取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～12μg的脯氨酸标准液。
加入表中试剂后，置于沸水浴中加热30min。取出冷却，各试管再加入4ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。
试 剂 10μg·ml-1脯氨酸标准液（ml） 蒸馏水（ml） 冰醋酸（ml） 2.5﹪酸性茚三酮（ml） 每管脯氨酸含量（μg） 管 号 0 0 2 2 1 0.2 1.8 2 2 0.4 1.6 2 2 4 3 0.6 1.4 2 2 6 4 0.8 1.2 2 2 8 5 1.0 1.0 2 2 10 -1
－1
－1
2or3or4 2 0 2
1.2用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。 1.3标准曲线的绘制
以1～5号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。 2. 样品的测定 2.1脯氨酸的提取
称取不同处理的植物叶片各0.5g，分别置大试管中，然后向各管分别加入5ml 3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。 2.2测定
吸取2ml提取液于带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml或3ml或4ml 2.5﹪酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，待分层（取上层液至10ml离心管中，在3000r/min离心5min），用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。 五、计算结果
从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：
X × 提取液总量（ml）
脯氨酸含量（μg·g1Fw）＝ ———————————————————
－
样品鲜重（g）× 测定时提取液用量（ml）
公式中：X －从标准曲线中查得的脯氨酸含量（μg）
六、文献
王晶英，敖红，张杰，曲桂琴.植物生理生化实验技术与原理M .哈尔滨：东北林业大学出版社，2003.7
十二抗坏血酸（ASA）
一、原理
维生素C（抗坏血酸）具有较强的还原力，可以把铁离子（Fe3+）还原成亚铁离子（Fe2+），亚铁离子与红菲啰啉（4,7-二苯基-1,10-菲啰啉，BP）反应形成红色螯合物。此化合物在波长534nm（有的指导525nm）处具有强的吸收峰，且吸光度与反应液中抗坏血酸含量呈正相
关。因此，可用比色法来测定抗坏血酸含量。 二、试剂
1．100μg/ml标准抗坏血酸溶液：称取1mg抗坏血酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用），用5%偏磷酸溶液溶解，定容至10ml，即1ml溶液含100μg抗坏血酸。现用现配，保存于棕色瓶中，低温冷藏。
2. 无水乙醇
3. 5% TCA（50g/L TCA）：称取5g三氯乙酸，用蒸馏水定容于100ml容量瓶中。 4．0.4%磷酸-乙醇溶液：量取0.47ml 85%磷酸溶液加入到无水乙醇中，并用无水乙醇稀释至100ml。
5．0.5%BP-乙醇：称取0.5g红菲罗啉（BP，纯度>97%），用无水乙醇定容于100ml容量瓶中。
6．0.3g/L 0.03tCl3-乙醇溶液：称取0.03g FeCl3加入到100ml无水乙醇中，摇匀。 7. 5% 偏磷酸：称取5g偏磷酸（HPO3），定容于100ml蒸馏水（需加热溶解，温度在50-60℃）偏磷酸有剧毒。（或者偏磷酸难溶解，先得用研钵提前研碎，后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容） 三、步骤
1. 制作标准曲线配制浓度为2mg/L（0.02ml标准液+0.98ml 5%偏磷酸），4mg/L（0.04ml标准液+0.96ml 5%偏磷酸），6mg/L（0.06ml标准液+0.94ml 5%偏磷酸），8mg/L（0.08ml标准液+0.92ml 5%偏磷酸），10mg/L（0.10ml标准液+0.90ml 5%偏磷酸），12mg/L（0.12ml标准液+0.88ml 5%偏磷酸），14mg/L（0.14ml标准液+0.86ml 5%偏磷酸）的AsA系列标准液。取各浓度标准液1.0ml于试管中，加入1.0ml 5%TCA、1.0ml乙醇，摇匀。再依次加入0.5ml 0.4%H3PO4－乙醇、1.0ml 0.5%BP－乙醇、0.5ml 0.03tCl3－乙醇，总体积5.0ml。将溶液置于30℃下反应90min，然后测定OD525。以AsA浓度为横坐标，以OD525为纵坐标绘制标准曲线，求出线性方程。
2. 提取取植物叶片1.0g，加5ml的5%偏磷酸溶液，在4℃下研磨，20000r/min离心15min，上清液供测定，5℃保存。（偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护ASA） 3. 测定
AsA测定取1.0ml样品提取液于试管中，按上述相同的方法进行测定，并根据标准曲线计算AsA含量。 4. 计算
根据吸光度值，在标准曲线上查出响应的混合液中抗坏血酸质量，按下式计算植物组织中抗坏血酸含量。植物组织中抗坏血酸含量以100g样品（鲜重）中含有的抗坏血酸的质量表示，即mg/100g。
V×m
抗坏血酸含量= ×100 (mg/100g) Vs×M×1000
式中，m为由标准曲线求得的抗坏血酸的质量（μg）；Vs为滴定时所用样品中提取液体积（ml）；
V为样品提取液总体积（ml）；M为样品质量（g）。
公式二
AsA(ug?gFW-1)=C×VT/(Vt×W)
VT、Vt分别代表提取液的总体积和参与反应中样液的体积；W为样品质量。 四、参考文献
中国科学院上海植物生理研究所，上海市植物生理学会. 现代植物生理学实验指南[M]. 北京：科学出版社， 2004. 315-316
十三二硫代硝基苯甲酸法测定谷胱甘肽（GSH）
一、原理
谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。
二、试剂 1. 5% 偏磷酸：称取5g偏磷酸（HPO3），定容于100ml蒸馏水（需加热溶解，温度在50-60℃）偏磷酸有剧毒。（或者偏磷酸难溶解，先得用研钵提前研碎，后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容）
2. DTNB（二硫代硝基苯甲酸）：25.1mg DTNB用pH6.8的磷酸缓冲液定容至10ml（用具塞刻度试管即可），现用现配，4℃保存。
3. NaH2PO4 （150m mol/L）（PH7.7）→称23.41g NaH2PO4 ·2H2O定容至1L（或称5.85定容至250ml）或者0.3mol/L Na2HPO4：称取Na2HPO4·12H2O 10.75g，溶于蒸馏水中，稀释至100ml。
4.100ml 100mM 磷酸缓冲液（PBS, pH=6.8）：B液0.1mol/l:1.78g Na2HPO4 定容至100ml蒸馏水。A液0.1mol/l：0.6805g KH2PO4 1.361g定容至100ml蒸馏水。A、B液各取50ml即可。
5. 1000μg/ml还原型谷胱甘肽标准溶液：称取100mg GSH分析纯，以5%偏磷酸定容至100ml，成1mg/ml即1000ug/ml的标准液。
三、步骤 1.提取。取植物叶片1.0g，加5ml的5%偏磷酸溶液，在4℃下研磨，20000r/min离心15min，上清液供测定，5℃保存。（偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护ASA） 2.取样品母液0.2ml，加入150 mmol/L NaH2PO4溶液（pH7.7）2.6ml 。 3.混匀再加入0.2ml DTNB溶液。
4. 在30℃保温10分钟，测定412nm波长下的光吸收值，调零管中的DTNB用0.2ml pH6.8的磷酸缓冲液代替参与上述过程。
标准曲线制作：取8支试管，编号，按照表1加入各种试剂，混匀，30℃保温反应10min。以0号管为参比调零，测定显色液在412nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，还原型谷胱甘肽浓度为横坐标，绘制标准曲线。
4.计算结果
显色反应后，分别记录样品管混合液的吸光度（ODs）和空白对照管反应混合液的吸光度（ODc）。根据吸光度差值，从标准曲线上查出相应的还原型谷胱甘肽量，计算还原型谷
胱甘肽含量（μmol/g）。 还原型谷胱甘肽含量（μmol/g）= 式中，n为由
标准曲线查的的溶液中还原型谷胱甘肽物质的量（μmol）；V为样品提取液总体积（ml）；Vs为吸取样品液体积（ml）；m为样品质量（g）。
公式二
GSH(mg?gFW-1)=C×VT/(Vt×W)
VT、Vt分别代表提取液的总体积和参与反应中样液的体积；W为样品质量。
李玲.植物生理学模块实验指导M .北京：科学出版社，2009
高俊凤.植物生理学实验指导M.高等教育出版社，2006：223～224