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[原创]菌体/细胞裂解法汇总 [精华] KILLUAHUNR
2005-12-06 23:11
由于上次求助无人回应，一气之下遍找资料，汇总出菌体/细胞裂解的常用方法和配方，希望能对其它求助兄弟有所帮助。
菌体/细胞裂解法汇总 一、反复冻融法：
1、将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞
TE
液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 http://cache.http://m.wodefanwen.com//c?word=′ó3|;???ú,á??a&url=http://www.bioon.com/experiment/mb/mb1/200410/80878.html&b=0&a=3&user=baidu 2、至少3次以上冻溶。
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/3895899_0.html 3、IFCC推荐法： 发
收集细胞悬液，4℃低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C 冷冻30 min，370C 解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。
贴:http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/252157_0.html 34、用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻 5 http://bbs.bioon.com/dispbbs.asp?BoardID=89&ID=142945&replyID=597858&skin积
=1 分:
2二、超声波处理法 得
1、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次
票:数20次。
7http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/3895563_0.html 状 离线
2、每个样本超声时间5秒,每个间隔5秒,粉碎5次。 http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/3895899_0.html 理。750W 40％功率。5秒超声，9秒间隔。超声至少90min。 http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1861187_0.html 4、综合冻融和超声的方法：
1500g离心，弃除上清。冰上，用小体积PBS重悬细胞。
将重悬液集中，1500g离心浓缩，弃除上清。液氮骤冷。用约5倍体积的PBS缓冲液重悬细胞，并搅拌。
可选择：4℃下超声破碎细胞。加入终浓度为0.25M的KCl，15mM的DTT。4℃下111500g×60min离心裂解液。取出上清。过柱子。
Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Alternate Protocol
三、渗透法：
冰冷的20 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），2.5 mmol/L EDTA处理，冰浴放置10min。 《精编分子生物学实验指南》
四、裂解液处理法：
1、细胞裂解液：50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。 http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1166442_0.html 2、在loading buffer加SDS，100度5分钟，是变性方法。SDS与蛋白等量结合，可以通过条带位移判断蛋白大小，考染不会影响结果。
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=4936753&sty=3&keywords=SDS+á??a 3、如果是做小量菌液，跑PAGE胶看其表达情况的话，可以直接加蛋白loading buffer煮沸5分钟即可，需注意的是上样前要离心12000rpm至少5分钟，然后上样时，枪头别吸最底下的。
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/2524891_0.html 4、20毫升细胞裂解液配方:40 μL 0.5M EDTA (PH8.0)，4 ml 10% SDS，1 ml 1M Tris-cl(PH6.8)，14.96 ml 蒸馏水。
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/196557_1.html 5、我始终未明白楼主如果想收集全蛋白，而不考虑包涵体的话，为何要用超声呢？直接水煮不就可以了吗？
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/2492252_0.html 6、将1ml菌离心弃上清，留大概50ul，再加50ul 2×上样缓冲液，煮10min，取20ul上样，就可以了。
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=4591035&sty=3&age=0&tpg=1&ppg态:3、100ml菌液离心，用8ml缓冲液悬浮，加8mg溶菌酶，冰浴30min，然后超声处
=1#4591035 7、检测蛋白诱导：
从培养的不同时期各取出1ml，12000g×1min离心。将沉淀重悬于100ul 1×SDS上样缓冲液（50mM Tris-Cl（pH6.8），100mM DTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油）中，100℃加热3min，然后12000g×1min离心。上样15ul，6％SDS-PAGE电泳。 《分子克隆》P826
8、5-10秒离心，弃除上清，用50ul蒸馏水重悬沉淀。加入1ul PMSF，再加入50ul热的2×SDS上样缓冲液（100℃加热）。迅速混匀后100℃加热3-5min。将样品冰上放置（或-20℃放置），然后再溶解，煮沸1min。离心30秒。上样5ul进行SDS-PAGE电泳。
2×SDS上样缓冲液：250mM Tris-Cl，6.2％（w/v）DTT，8％SDS，0.002％（w/v）溴酚蓝，40％甘油。
Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli。
9、裂解液：50mMTris-HCl(pH8.5~9.0)，2mMEDTA，100mMNaCl，0.5%TritonX-100，1mg/ml溶菌酶。
http://cache.http://m.wodefanwen.com//c?word=′ó3|;???ú,á??a&url=http://www.bioon.com/experiment/mb/mb1/200410/80878.html&b=0&a=3&user=baidu 10、我们用NP40（NP40：NONIDET p-40 乙基苯基聚乙二醇，是一种非离子表面活性剂。）加DTT和蛋白酶抑制剂裂解细胞，冰上放30－60min，然后13000rpm离心15min，取上清定量。
http://bbs.bioon.com/dispbbs.asp?BoardID=89&ID=112749&replyID=421724&skin=1 11、裂解液配方是：50mmol/L Tirs-HCI (PH 8.0)，150mmol/L NaCI，0. 02% 叠氮钠，100μg/ml PMSF，1μg/ml Aprotinin，1% Triton X-100 ( or NP-40)。 http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1168826_0.html 12、对于组织培养中生长的细胞，最有效的裂解方法是用去污剂（表面活性剂）进行处理，溶解细胞膜并溶解蛋白质。50mmol/L Tirs-HCl(PH 8.0)、150mmol/L NaCl、0. 02% 叠氮钠、100μg/ml PMSF、1μg/ml Aprotinin、1% Triton X-100 ( or NP-40) ，这种裂解液可能是最常用的裂解缓冲液。
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1172173_0.html 13、细胞裂解液的主要目的：（1）利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；（2）溶解蛋白；（3）蛋白变性使其稳定；（4）抑制蛋白酶活性。
推荐RIPA buffer:50 mM Tris-HCl pH 7.4（缓冲体系），150 mM NaCl（等渗体系），1 mM PMSF （强大的蛋白酶抑制剂），1 mM EDTA（变性剂和稳定剂），5 μg/ml Aprotinin（蛋白酶抑制剂），5 μg/ml Leupeptin（蛋白酶抑制剂），1% Triton x-100（破坏细胞），1% Sodium deoxycholate（中度变性剂和蛋白溶解剂），0.1% SDS（强变性剂和蛋白溶解剂）。
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/532062_0.html 14、裂解buffer：50mM HEPES pH7.0，1mM 甘油，1mM DTT（还原剂），7M 尿素，2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解），1mM EDTA(金属鏊合剂），1mM PMSF，1mg/ml leupeptin，1mg/ml aprotinin，1mg/ml pepstatin(蛋白酶抑制剂），50mM NaF(ph7.0)（anti hemoaggulating），1mM Na3VO4(ph7.0)（inhibitor of phosphatases），2mM benzamidine（inhibitor of trypsin）。
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1049377_0.html 15、可选择：取0.5ml诱导的细胞并离心2min。弃除上清，用100ul 1×SDS上样缓冲液重悬，冰上放置。
6000rpm×10min离心培养物。弃除上清，用10ml预冷的裂解液重悬沉淀。液氮骤冷细胞或-20℃冷冻细胞。在冷水中溶解细胞。15秒、4次超声处理细胞。冰浴降温。4℃，9000g×30min离心。取上清。
裂解液：5 mM DTT，15 mM KCl，5 mM MgCl2，50 mM HEPES, pH 7.9，1 mM EDTA，10 mg/ml溶菌酶（临用前加上DTT和溶菌酶）。 Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Basic Protocol
16、收集细胞。在液氮中突然冷冻细胞。用含有蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液悬浮沉淀。用100 μg/ml溶菌酶处理并在冰上孵育15 min。加上10% N-laurylsarcosine (终浓度1.5%)，然后超声波破碎。16000 rpm×30 min离心。取上清然后加入Triton X-100至终浓度为2.0%。过Ni-NTA–琼脂糖柱层析。
20021108 edited on 2007-07-15 23:43
? 有没有中级没过的啊？ biosepq
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大白龙
丁香园荣誉版主
发贴: 3194 积分: 262 得票: 5 状态: 隐身 峨嵋九九
? 【原创】脊柱微创介入治疗 很好,非常感谢有心人
2005-12-07 19:45
? 【原创】兄弟们中级成绩可以查了
2005-12-06 23:54
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10非常不错 7
? 【每周一问】NO.91-Epidural anesthesia（part1）
2005-12-10 14:10
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