天津师范大学化学与生命科学学院分子生物学期末实验报告
实验名称：功能基因表达载体的构建 11级水生生物 李雪静 1110170036 2010-1-20
一、 实验目的：构建功能基因kazal的表达载体。
二、实验流程：基因克隆——→小片段（kazal）制备、大片段制备——→kazal基因与目标
载体连接——→蛋白质的诱导表达
三、实验过程
（一）2012年6月6日上午：PCR扩增目的基因A
1.1 实验原理：PCR（polymerase chain reaction）技术是Kary Mullis 在1985年建立起来的
在细胞体外合成DNA的一种方法。依DNA半保留复制原理，利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，在附加的两个引物与模板杂交之后，按碱基配对原则经酶促反应合成DNA片段，包括模板变性、引物退火及用DNA聚合酶延伸两个引物之间DNA的一定次数的重复循环，使包括在两个引物5′端限定的特异性片段形成指数式积累。整个过程操作简单，可在短时间内在小管中获得大量的特异的DNA拷贝，这一特点使PCR技术很快被应用到了分子生物学研究的广大领域。扩增DNA的特异性主要取决于引物和模板相结合的特异性，每个循环的反应分为3步：
（1）模板变性（template denaturation）：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成游离
于溶液中的单链DNA。
（2）退火（annealing）：温度突然降低，反应体系中的引物能准确地配对于被扩增区域的
两个侧翼。这是因为模板分子结构比引物的结构复杂得多，而且引物的拷贝数远高于模板DNA的拷贝数，因此引物与模板DNA形成复合物的概率要大大高于模板DNA两条单链的重新结合。
（3）延伸（extension）：在DNA聚合酶、4种脱氧核糖核苷三磷酸及Mg存在的条件下，
DNA聚合酶催化以引物为起始点的5′--3′DNA链延伸反应。n个循环后，一个模板得到的扩增拷贝为2-1。 1.2 实验步骤：
以菌液为模版，进行PCR反应，扩增目标基因。
n
2+
25μl反应体系为： 10× PCR buffer（Mg2+） 2.5μL dNTP 2 μL ExTaq DNA Polymerase 0.2μL 水（灭菌的去离子水） 15.875μL
模板 1μL 上游引物 1μL 下游引物 1μL
反应条件为：94℃，4min
94℃，1min
60℃，1min 25cycle 72℃，1min 72℃，10min
15℃，保温
（二）2012年6月7日 电泳检测kazal基因及回收
并把获得的kazal基因片段接入T载体
2.1电泳检测：
（1）称取0.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30mL的蒸馏水和400μL TAE电泳缓冲液，
置微波炉中加热至液体完全澄清，取出后摇匀，冷却到50℃左右，加入EB 染料1μL，摇匀，使之完全溶解
（2）倒入插有梳子的制胶槽中(注意不要形成气泡)，凝胶厚度一般为1cm左右，室温冷却
30～40min。
（3）待胶凝固后，取出梳子并将凝胶放入电泳槽中，加入足够的1×TAE电泳缓冲液，覆盖
凝胶约1mm，用移液枪将已经加入3μL上样缓冲液的样品和Marker分别加入到加样孔中(记录点样顺序及点样量)。
（4）接通电泳仪电源(注意正负极，RNA片段从负极向正极移动)。 （5）30分钟左右后，将凝胶放入凝胶成像仪内观察、照相。
2.1.1实验结果：
2.2 割胶回收
（1）在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计
算凝胶重量（提前纪录1.5mL离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（100mg=100μL体积）。
（2）加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合（每2—
3min），直至凝胶完全熔化（6—8min）。
（3）加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。当分离的DNA片段小段小鱼
400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇。
（4）吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2mL离心管）中，1200 ×g，离
心1min，弃滤液。
（5）将制备管置于2mL离心管，加500μL Buffer W1，12000 ×g，离心30s，弃滤液。 （6）将制备管置回2mL离心管，加700μL Buffer W2，12000×g，离心30s，弃滤液。
以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次，12000 ×g，离心1min。（确认W2
中加入指定体积无水乙醇）
（7）将制备管置回2mL离心管中，12000×g，离心1min。
（8）将制备管置于1.5mL离心管中，在制备膜中央加25—30μL Eluent或去离子水，室温
静置1min，12000×g，离心1min。 2.3 T载体连接 （冰上操作）
5μL体系 solutionΙ 2.5μL DNA 2.1μL T载体 0.4μL
混匀后离心，16℃过夜培养。
（三）2012年6月8日上午： E.coli TOPO感受态细胞的制备 2012年6月8日下午：E.coli TOPO感受态细胞的转化
3.1制备感受态细胞
（1）取25g LB Broth Medium培养基，加入1L蒸馏水，加热溶解后分装在试管中（每管
3ml）。灭菌后冷却备用。
（2）摇菌：取保好的菌种50μl加入到3ml培养基（无Amp）中，37℃，180rpm，摇菌
过夜。
目的：使菌体充分生长，增加菌体的浓度
（2）菌种复摇：将前夜摇菌（37℃，180rpm，无Amp）拿出，抽100μL于3mLLB培养
基（无Amp）中，继续摇2—3h，当看到绸缎样取出。
目的：上述菌液经过摇菌一夜后，肯定过了对数生长期，所以为了获得对数生长期的菌液，须再在一个新的环境里摇1-2h，使还存活的菌继续生长达到对数期，而生长处于末期的菌在新的培养基里也不会存活。
（3）去1mL置于EP管中离心，3000rpm，3mim，倒去上清，若菌体少可在加1mL。 （4）超净工作台下，吸取残留上清，每EP管加100μL 预冷的Cacl2（0.1M）4℃轻柔反复
吹打，放入冰中再放入4℃冰箱，3h后可用。
（CaCl2的作用：在沉淀中加入CaCl2以后，Ca2+会形成羟基钙磷酸复合物，它可以吸
附在大肠杆菌细胞的表面，作用① 使大肠杆菌细胞膜膨胀，膜的流动性变差，呈现晶格状态，进而易使连接产物进入到细胞当中；② 抗DNA酶，防止把转化的DNA片段打断） 3.2 转化
（1）制培养基平板：已灭菌的LB培养基在摸着不烫手的时候，加入氨苄，之后倒平板。
（一般1ml培养基中加1μl氨苄母液，氨苄母液1ml溶液中有0.1g氨苄）
（2）将100μL感受态细胞和5—10μL连接物混匀，冰浴30min。 （2）42℃热击90s，迅速转移到冰浴中2-3min
（3）加800μl培养基（无Amp），培养箱中培养45分钟，条件：37℃，150rpm。
（目的：让菌进一步生长，扩大浓度）
（4）将摇好的菌3000rpm离心5min，弃掉900μl上清，用枪把剩下100μl上清与沉淀混
匀。在超净台中，取此菌液涂在平板上，37℃倒置培养。
（说明：因为T载体上有抗氨苄的基因，因此涂平板后，已转化成功的大肠杆菌感受态细
胞可生长成为单克隆菌落，未转化成功的将不会生长。
注意：① 感受态最好现用现制，最多不能超过24h，但如果为了避免每次现用现制太麻
烦而制了一大批，则可以把它放入液氮中速冻，然后取出保存在-80℃的冰箱里，使用期限为1个月；
② 摇菌震荡的时候，大的试管和锥形瓶可以垂直放着摇，但小的管则要水平放置着摇，这样才会摇的比较均匀充分；
③ 在平板中培养菌体时，平板要倒置，防止蒸发的水分落在平板的菌落上） （四）2012年6月9日上午挑克隆 （1）将3μl Amp加入3ml LB培养基中。
（2）将加入Amp的LB培养基分至6个EP管中，每管500μl。
（3）将过夜培养的平板取出，在超净工作台中，用黄色枪头挑一个单克隆菌落，在（2）
中的培养基中蘸一下。
（4）摇菌37℃，180rpm，4-5h后检测。
（五）2012年6月9日下午 PCR扩增检测克隆Kazal基因 电泳检测 2012年6月10日 摇菌保种 5.1 PCR反应检测Kazal基因
25μl反应体系为： 混合液（buffer，loading，mg2+，酶） 12.5μL 水（灭菌的去离子水） 10μL
模板 （菌液） 1μL 上游引物 1μL 下游引物 1μL
反应条件为：94℃，4min
94℃，1min
60℃，1min 25cycle 72℃，1min 72℃，10min
15℃，保温 5.2电泳检测：
（1）称取0.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30mL的蒸馏水和400μL TAE电泳缓冲液，
置微波炉中加热至液体完全澄清，取出后摇匀，冷却到50℃左右，加入EB 染料1μL，摇匀，使之完全溶解
（2）倒入插有梳子的制胶槽中(注意不要形成气泡)，凝胶厚度一般为1cm左右，室温冷却
30～40min。
（3）待胶凝固后，取出梳子并将凝胶放入电泳槽中，加入足够的1×TAE电泳缓冲液，覆盖
凝胶约1mm，用移液枪将PCR反应产物和Marker分别加入到加样孔中(记录点样顺序及点样量)。
（4）接通电泳仪电源(注意正负极，RNA片段从负极向正极移动)。 （5）30分钟左右后，将凝胶放入凝胶成像仪内观察、照相。 实验结果：
条带大小与目标基因的大小一致，即可确定其为Kazal基因。