基因工程作业复习提纲
一、名词解释
基因工程、基因克隆、显性质粒、质粒DNA、染色体DNA、Southern印迹、Western印迹、PCR技术、限制性内切酶、相容性末端、部分酶切、标记基因、T克隆、表达载体、基因组文库、目的基因、RT-PCR、受体细胞、感受态细胞、外植体、基因工程药物、核酸疫苗、转基因动物、基因治疗、表达系统、包涵体蛋白、星活性、 结构基因、cDNA文库、启动子、酶单位、定量PCR、电穿孔转化法、基因枪法。
基因工程：在体外将目的基因片段插入载体上，构建重组DNA（基因的新组合),并使之进入到原先没有这类分子的受体细胞内，而能持续稳定的增殖和表达的过程。基因工程又名： 遗传工程(genetic engineering) 重组DNA技术(recombination DNA technique) 分子克隆(molecular cloning) 基因克隆(gene cloning)
基因克隆：基因工程的核心内容是基因克隆和基因表达
染色体DNA：分离目的基因和基因表达调控因子的主要材料，也可提供构建染色体和染色体基因整合平台系统之用
标记基因：当载体进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。这才介于克隆操作。即带有筛选标记或抗药基因
TA克隆载体：用耐热DNA聚合酶经PCR法扩增基因片段时、将PCR产物的3’端加上了一个A。根据这一特点研制出一种线性质粒，其5’端突出的T，它们之间可以连接，即TA克隆。
表达载体：原核表达载体 表达载体中含有复制起始位点、抗性基因 、克隆位点 、启动子 、核糖体结合位点和转录终止信号。
基因组文库: 某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌中的群体之中，这个群体极为该生物的基因组文库。
目的基因: 优良性状相关的基因，即用于克隆的基因
受体细胞: 能够接受外源DNA并使其稳定维持的细胞，也指具有应用价值和理论研究的细胞.
电穿孔转化法: 将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。
表达系统: 泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达目的基因产物。
包涵体蛋白:在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密的聚集在一起
形成无膜的裸露结构。
二、简答及问答题
1、基因工程研究的技术路线是什么？
答: 基因工程研究的成败是与技术路线的严密设计直接相关。
在国内外已发表研究成果
确定研究目标
自己提出的技术路线
严密设计可 行技术路线
生 物 材 料 mRNA DNA RNA cDNA文库 基因组文库 人工合成 克隆载体 酶切 转基因生物 目的基因 + 重组DNA
导入 受体细胞 筛选 克隆子 2、重组DNA的含义是什么？
答：在体外将目的基因片段插入载体上，构建重组DNA（基因的新组合),并使之进入到原先没有这类分子的受体细胞内，而能持续稳定的增殖和表达的过程。
3、为什么反转录酶在聚合反应中会出错?（书上32页） 3、天然DNA包括那些类型DNA？
答: 染色体DNA 病毒和噬菌体DNA 质粒DNA 线粒体和叶绿体DNA
4、Northern印迹和Southern印迹的两个根本的区别是什么？
答;Southern Blotting的过程 1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA 2.通过电泳液的移动转移胶中的DNA
3.固定胶中的DNA
4.预杂交和杂交（放射性和荧光检测） 5.结果检测
Northern blotting（RNA印迹技术）
是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法
5、用于核酸杂交的硝酸纤维素膜和尼龙等膜固相支持物具有哪些优良特性?
6、严禁核酸杂交试验是如何控制的?
7、什么限制性内切酶的星号活性? 受哪些因素影响？
答:限制酶在非标准反应条件下，能切割一些与之特异型识别顺序类似的序列，降低酶切的特异性，这种现象称为星号活性。EcoRI*代表EcoRI的星号活力。
发生星反应的限制酶和条件
1)反应体系中甘油含量过高（>5%，V/V），应使用能完全酶切DNA的最小酶量避免这种情况的发生；
2)限制酶用量过大（>100U/ug DNA）； 3)低离子浓度（<25mmol/ml）； 4)高PH（PH8.0）
5)含有有机溶剂（如二甲基亚砜、乙醇、二甲基乙酰胺等）； Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价阳离子存在。
6)不同的限制酶出现的星号活力的阈值也不一样，常易发生星号活力的酶有：EcoR I、Hind III、Kpn I、Pst I、Sca I、Sal I、Hinf I等。
8、Klenow酶在基因工程中有什么作用？（书上31页） 9、克隆载体应具备特点？
答：1. 复制起点：因而至少可在一种生物体中自主复制。2. 克隆位点：以供外源DNA插
入。3. 遗传标记基因：以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞4.安全性： 不含有害基因，不会任意传播其他宿主细胞，尤其是人细胞。
10、阐述减少质粒和噬菌体载体上某种酶的识别位点的方法和原理? 11、什么是质粒的相容性？什么是不相容型？
相容性 在一个宿主细胞中同时存在的不同质粒 不相容型 不能同时存在一个细胞中的不同质粒
12、阐述Ti质粒的4个功能区？T-DNA区:Ti 质粒进入植物细胞的只是约25kb
的片段，这个片段称为T-DNA（transfer DNA); T-DNA两端各有25bp长的正向重复序列(LTS和RTS)。 边界序列对T-DNA转移和整合是不可缺小的，如其发生突变和缺
失，导致T-DNA转移功能降低，甚至导致丧失。
Vir区:Vir区—定位在T-DNA区上游的一组基因，它们的表达产物激 活T-DNA向细胞
的转移，使植物引发肿瘤，与脓杆菌的致病性相关（virulence）。 Con区: Con区与脓杆菌之间的接合转移，即含有tra基因。 Ori区: 该区的基因能控制Ti质粒的自我DNA复制
13、什么是cDNA文库？同基因组文库有何差？cDNA文库来自于某一物种
某种组织的mRNA，所以cDNA文库既有种属特异性，也有组织特异性。cDNA文库的特点：基因特异性 器官特异性 代谢或发育特异性 不均匀性 各cDNA均可获得表达（一般选用的载体都是表达型的）
14、建立一个基因组文库后，如何鉴定一个含有目的基因的克隆？
15、有哪些可能的原因使一个基因在DNA文库中丢失?
16、选择受体细胞的一般原则？(1)便于重组体分子的导入
(2)能使重组体分子稳定存在于细胞中
(3)便于重组体筛选，表达载体所含的选择性标记与受体细 胞的基因型必须相配。
(4)遗传稳定性高，易于培养。对于动物细胞而言，应对培 养的适应性强，可以进行贴壁培养或悬浮培养，最好能 在无血清的培养基中培养。
17、CaCl2诱导大肠杆菌转化法的可能机制？(1) 在0℃的CaCl2低渗溶液中，
细菌细胞发生膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离，形成感受态。
(2) Ca2+与DNA分子结合，形成抗DNase的羟基－磷酸钙复合物，并粘附在细菌表面。 (3) 当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多缝隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。
18、重组子筛选的营养缺陷型检测法？根据目的基因在受体细胞中表达产物的
性质，筛选出含目的基因的克隆子，如果目的基因产物能降解某些药物使菌株产生抗性标记，或基因产物与某些药物作用是显色反应，则可根据抗性或颜色直接筛选出含目的基因的克隆子。
前提：目的基因能在受体细胞中表达，不能表达则不能检测。
19、从细菌中提取基因组DNA，应采取哪些措施可获得高分子量的DNA?
答：（一）保持核酸分子一级结构的完整性 1）温度不要过高；
2）控制一定的pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定的离子强度;
4）减少物理因素对核酸降解的机械剪切力. （二）防止核酸的生物降解
细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。
20、阐述提高外源蛋白表达量稳定性的措施？（1）构建融合蛋白表达系统
（2）构建分泌蛋白表达系统（3）构建包涵体表达系统（4）选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统
21、用亲和层析纯化外源基因表达蛋白的原理？
22、用IFNα来治疗哪些疾病？白血病、肝炎、癌症、AIDS 23、为什么要研究和应用转基因动物？
? 提高动物生长速度
? 改善畜产品的品质
? 用转基因动物生产药物
? 用转基因动物作器官移植的供体
24、 何理解基因工程两个特点？ 25、简述复制子的结构和功能?
26、阐述SangerDNA测序法测定基因测序的原理？（书上157页）
答：双脱氧（2'，3'）-核苷酸可以象2'-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因其3’ 端不具OH基，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列。
27、用于克隆的DNA在质量上有那些要求？
28、对于电泳分离DNA来说，琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶各有什么特点？
29、说出4种外源DNA转化植物细胞的方法？
30、用限制性内切核酸酶切割DNA后，经电泳检查，发现有拖尾现象，其可能的原因是什么 ？（可能的原因有：蛋白与DNA的结合、酶混杂、酶
切条件不适合、有外切核酸酶污染等）。
31、如果已知某一基因的功能及其编码的蛋白质氨基酸序列，可以通过何种方法克隆该基因？
32、用蓝白斑筛选法区分重组子和非重组子的原理？ 33、放射性抗体检测法的基本原理是什么？
（答：这一方法的原理是根据抗体、抗原分子的三个基本特性而设计的一种筛选鉴定重组体的方法。这三个基本特性是：（1）抗体分子可以牢固地吸附在固体基质上而不被洗脱掉；（2）一个抗原可以同几种不同的抗体结合；（3）抗体分子可以通过碘化作用被标记）。