溶液。
(2)用牙签取口腔上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色10 一15分钟(注意不能干燥)，盖上盖片，吸去多余的溶液，即可镜检。 （三）台盼蓝染色鉴别死活细胞。
抽取小鼠腹腔水细胞涂于洁净载玻片上，滴加l％台盼蓝1滴，盖上盖玻片于显 微镜下观察。
五、作业
1．所观察到的液泡大小是否有差别，染色深度是否一样，并绘图加以说明。 2．所观察到线粒体分布在细胞何处．呈什么颜色，其形状如何，绘图加以说明。 3．比较线粒体在动、植物中的分布、颜色，其形状如何?
实验八 细胞器的分离、纯化——细胞分级分离法
一、实验目的
学习细胞器的分离及纯化的一般原理和方法。
二、实验原理
细胞分级分离法是一种通过离心从而分离细胞内不同结构成份的细胞器(包括核、叶绿体、线粒体、微体等)以研究其形态结构，化学组成成份和生理活性的方法。 这个方法包括匀浆化，分级分离，分析三个步骤。通过匀浆化得到细胞匀浆液；把匀浆液放在一定的液体环境下，在离心机中进行离心分离处理。因为离心力的作用，可以把细胞内比重和大小不同的各种结构分开。
细胞器的沉降速度取决于辐射向外的离心场，我们通常用相对离心场表示： RCF=1．11×10·nr
其中RCF为相对离心场(单位为g)；n为转数(单位为转数／分)；r为离心半径(单位是
cm)
-5
2
三、实验用品
(一)材料：新鲜菠菜
(二)器械：显微镜、高速低温离心机、普通离心机、离心管、200目的尼龙网、
漏斗、烧杯、组织研磨器等。
(三)试剂
1．线粒体离心匀浆介质：
0.25 M蔗糖。0.067 M PH7.2PBS，0.05M EDTA，0.75mg／ml牛血清白蛋白。 2．l％Janus green B的O．25M蔗糖溶液。
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3．0.05M Tris—HCl液体 PH 8.0 0.02M Tris 55ml 0.1N HCl 55ml 蒸馏水200ml
4．0.35mol/lNaCl
四、实验方法
(一)玉米黄化幼苗线粒体的分离(整个过程保持在O-4℃)
1．将玉米黄化幼苗剪下，称重每小组约取5g，在冰箱中放置l小时。 2．将幼苗剪碎直接倒入研钵中，以l∶3(重量体积比g：m1)比例加入离心匀浆 PBS介质，快速磨碎，注意先加入少许介质液，研碎后再将余液加入。 3．用双层尼龙网过滤，除去残渣。
4．取滤液在低温高速离心机上2300rpm离心lO分钟，弃沉淀。 5．取上清液在低温高速离心机上9950rpm离心lO分钟，弃上清。 6．所留沉淀用匀浆介质液洗涤，仍以9950rpm离心10分钟．弃上清。 7．将所得沉淀悬浮于0.5M、PH7.2甘露醇中，置冰箱备用。
8．将制备的线粒体悬液滴于干净的载玻片上，用1％Janus green B的0.25M蔗糖
液(PH7.4)染色20分钟。
9．加盖玻片(需特别干净)。镜检最好用相差显微镜,凡线粒体均被Janus green B 染成蓝绿色颗粒，检验制备线粒体的纯度。 (二)菠莱叶叶绿体的分离(整个过程保持在0℃)
1．取去叶脉的新鲜菠菜5g于研钵中，加入0.35mol/lNaCl 15ml研磨。注意开始研
磨时也是先加入少许介质，磨碎后再加入剩余的。
2．绿色的匀浆液用尼龙网(200目)过滤．滤液分别转入两支干净的离心管中，以
1000rpm离心4分钟．除去沉淀。
3．上清液在高速低温离心机上以3000rpm离心5分钟，所得沉淀即为叶绿体。 4．用0.35mol/lNaCl液(视沉淀多少)稀释，置冰箱中保存备用，在干净的载玻片上
滴一滴叶绿体悬液，加盖玻片(需特别干净)在显微镜下观察叶绿体的形态。
五、作业
1．线粒体，叶绿体形态如何?叶绿体分离的是否完整。 2．检验你的分离两种细胞器的纯度如何? 3．为什么在分离过程中要求研磨快速且保持低温?
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实验九 植物原生质体分离及融合
一、实验目的
学习植物原生质体的分离及融合的原理，掌握其操作方法。
二、实验原理
植物原生质体是具有质膜，但去掉了细胞壁的植物细胞，分离的原生质体在培养条件下具有再生新壁，进行连续的细胞分裂．并分化成完整植株的能力，即具有细胞全能性。细胞壁的主要成份是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶，果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁。由于质膜完全暴露，原生质体具有摄取大分子(如核酸)，细胞器(如核、叶绿体)和细菌，病毒的能力，因此是进行遗传操作，基因转移的好材料。而原生质体融合是实现上述目的的一个极为重要的手段。同种或异种原生质体可在聚乙二醇(PEG)诱导下产生异核体，实现体细胞杂交，实现广泛的遗传重组，创造新的生物类型。
三、实验用品
(一)材料：植物叶片(菠菜叶片)
(二)用具：倒置显微镜，离心机。过滤筛(100目)，漏斗，烧杯，吸管，长注射
针，注射器(5-10m1)等；
(三)试剂：
1．纤维素酶2％，果胶酶l％。
在0.65M甘露醇，0.05MCaCl2·2H20和0.1％MES中，PH调至5.6-6.0。 2．0.16M CaCl2·2H20溶液(内含0.1％MES)PH5.6。 3．22％蔗糖溶液。 4．30％聚乙二醇(PEG)溶液 5．高PH高钙洗脱液(PH=9) 0.1M CaCl2·2H20 0.1M梨酶醇
0.5ml／100ml 1M Tris 6．0.24M CaCl2·2H20
四、实验方法
(一)原生质体的分离收集：
1．取菠菜叶片撕去下表皮，每小组称0.2g．切成小块放到10ml酶液中，在26℃
下酶解4-5小时，或酶含量减半过夜，期间轻轻摇动几次。 2．用100目的过滤筛过滤。
3．用与滤液等体积的0.16M CaCl2·2H20溶液冲洗过滤筛，使冲洗液冲入过滤液。
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4．滤液用离心机100-300rpm，离心5分钟弃上清。
5．沉淀中加入0.16M CaCl2·2H20溶液1-2ml于沉淀，轻摇使之悬浮，用带长针
头的注射器自离心管底部轻轻地加入6-8ml 22％蔗糖溶液，使之形成界面。 6．静置待原生质体形成一条带时弃去上、下液及残渣，用吸管吸取收集原生质体。 7．用0.24M CaCl2·2H20溶液洗涤一次，离心吸去上清液。
8．沉淀中加入l-2ml O.16M CaCl2·2H20溶液悬浮沉淀，用血球计数板计数，使
原生质体密度为2×10个／ml。
9．取一滴于载玻片上，低倍镜观察原生质体的纯度和完整性，也可用荧光显微镜
检查。
(二)原生质体融合操作
1．取上述原生质体液两滴，间隔5mm滴于载玻片上，静置l0分钟，使原生质体
沉淀在载玻片上。
2．在两滴悬液之间加1滴30％PEG液，使3滴溶液相连，室温下(15℃-20℃)
作用5-l0分钟，在显微镜下观察原生质体粘连情况。
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五、作业
1．说明原生质体脱壁是否完全，形态是否完整。 2．绘制所观察到的原生质体，粘连或融合情况。
实验十 植物细胞骨架的光学显微观察
一、实验目的
观察光学显微镜下细胞骨架的结构，了解显示植物细胞骨架的方法及其原理。
二、实验原理
细胞骨架是指在细胞中支持和连接细胞各组分，以及与细胞运动有关的结构，它包括微管、中间纤维、微丝。当用适当浓度的Triton X-100处理时，可将细胞内大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白质却仍被保存，经过固定和考马斯亮蓝R250染色，从而在光镜下观察到细胞骨架的网状结构。
三、实验用品
(一)器材：显微镜、50ml烧杯、滴管、容量瓶、载玻片、盖玻片、镊子。 (二)试剂：
1．M一缓冲液：50mmol／L咪唑，50mmol／L kCl：，0.5 mmol／LMgCl2，
lmmol／L EGTA(乙二醇双(a-氨基乙酸)醚四乙酸)，0．1mmoL／L EDTA，lmmol／L巯基乙醇或DTT(二硫苏糖醇)。
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2．6mmol／L PH6．8磷酸缓冲液。 3．1％Triton X-100，用M-缓冲液配。
4．0.2％考马斯亮蓝R250，其溶剂是甲醇46.5ml，冰乙酸7ml，蒸馏水46.5ml。 5．3％戊二醛，用6mmol／L磷酸缓冲液(PH6．8)配制。 6．5％、7％、95％乙醇。
7．叔丁醇、正丁醇、二甲苯、树胶。 (三)材料：洋葱鳞茎。
四、实验方法
(一)取洋葱鳞茎内表皮细胞(约lcm大小)若干片温于装有PH6．8磷酸缓冲液
的50ml烧杯中，使其下沉。
(二)吸去磷酸缓冲液，用1％Triton X-100处理20-30分钟。 (三)吸去Triton X-100，用M-缓冲液洗3次，，每次10分钟。 ． (四)3％戊二醛固定0.5-1小时(对照组开始处理)。 (五)PH6.8磷酸缓冲液洗3次，每次10分钟。 (六)用0.2％考马斯亮蓝R250染色20-30分钟。
(七)用蒸馏水洗1-2次，材料置于载玻片上，加盖玻片，即可镜检。 (八)如作永久制片，可使样品顺序通过如下试剂：50％乙醇，70％乙醇，95％
乙醇，95％乙醇和叔丁醇混合液(1：1)，每次5-10分钟，或正丁醇→正丁醇→二甲苯→二甲苯，每次5-10分钟。然后捞取样品，平展于载玻片上，中性树胶封固。
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五、作业
1．比较对照组和处理组的细胞骨架结构有何不同？ 2．绘制细胞骨架图。
实验十一 鉴定RNA的细胞化学方法一Branchet反应
一、实验目的
通过实验了解Branchet反应的原理及操作方法，观察DNA、RNA在细胞内分布的主要位置。
二、实验原理
Branchet反应是鉴定细胞内的RNA的一种标准方法，主要是利用核酸分子上的负电荷(PO4)与带正电荷的碱性染料结合形成盐键而在原位沉淀显色，所以它可以同时染出RNA和DNA。
Unna试剂中的甲基绿(methyl green)和DNA亲和力高，派若宁(Pyroin)和RNA
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