介绍几点Sephadex的粗浅经验吧：
1、选柱原则：交联葡聚糖凝胶在大G值时，柱过长就会影响流速，此时选用柱一般都较短而稍粗。反之 ，G值小时用柱不妨长些。待分离物质的分子量与G值有一定的关系，可以参阅一些书本。
2、装柱前要仔细把柱底和管子内的气体排出，当然这要有些技巧的。
3、装柱时速度要慢些，放的速度与装凝胶的速度要保持一致。这样才能避免产生气泡和分层。
4、液位差不能超出正常范围，否则凝胶会变形，至少会影响流速。常用正常值如下： G-25：40-160cm G-100：24-96cm G-150：9-36cm G-200：4-16cm
5、样品上柱量 ：SephadexG-200的凝胶上柱体积，大约是床体积的1/50左右，小G值的凝胶上柱体积则大约是床体积的1/100左右。如果待分离两物质的分子量靠得很近，上述体积比还可以小些。如果上柱样品的比重大一点，上样的样品能形成很好的界面。 6、上样时切勿冲动床面，也不能使凝胶干涸。
7、样品洗脱峰的检测：蛋白质测定常用波长280nm，但如蛋白质样品很稀，则可在230-235nm波长处检测。謻肽不含酷氨酸和色氨酸，极个别蛋白质也不含两种氨基酸，则必须用225nm波长。
首先肯定是用下层的，你可以看下下层体积够不，G-25溶胀体积2.5ml/g，再一个取下层微球在显微镜下看球的粒径情况，球是否充分溶胀，有溶胀后的粒径大小，一般湿胶是38um~235um。
再一个看看上层絮状物在显微镜下的情况，这种情况都会遇到的，直接把上层倒掉，用下层胶装柱。
3 使用方法 3.1 乙醇浸泡
在室温下，将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用去离子水洗去残存的乙醇滤干。 3.2 去离子水浸泡
室温下，在去离子水中充分溶胀24小时，间隙搅拌，以保证凝胶的完全溶胀。 3.3 盐酸浸泡
在常温下再用0.2N HCl浸泡12小时，间隙搅拌，滤干，水洗至中性。 3.4 装柱
将溶胀好的凝胶根据装柱要求一次性置入柱内，注意保持湿态装柱，并避免柱内产生气泡或断层。 3.5 平衡
上样前平衡层析柱至少3-5个柱体积直到基线变得平稳为止（流出液的PH值等于上柱的Buffer的PH值） 3.6 上样
凝胶过滤的上样量一般为5%的柱床体积，我们建议初次上样控制在1-2%的床体积，视分离情况可以调整；脱盐时上样量可以达到20%的柱床体积，柱高的选择也与分离要求相关，柱高控制在40-50 cm 以下，过高的凝胶层会引起较大的反压，应当尽可能避免。难分离物质要有一定柱高和流速控制，脱盐时高径比为5：1即可。 3.7 洗脱方法
可以用去离子水，也可以采用上柱时的缓冲液洗脱；在上柱Buffer中加入NaCl等梯度洗脱或盐梯度洗脱也可以完全分离纯化。 3.8 在位清洗（CIP）
凝胶使用十次后作一次CIP，目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。方法是以40cm/h用1M氢氧化钠反向洗四个柱体积，再以至少三个柱体积平衡缓冲液再生。