诱变米曲霉最佳时间梯度
摘 要： 在曲霉家族中，米曲霉占有非常重要的地位，不仅可以产生蛋白酶，还可产生淀粉酶，糖化酶等，把生物大分子分解为易于吸收的各种小分子，以利于吸收，由于实验室条件比较简陋，不能把米曲霉的特性用于人体中，而动物体的要求比较低，就想利用物理，化学诱变等方法，诱变出生长速度快的菌株，以用于饲料生产。
关键词：米曲霉；紫外线；诱变；微波 1 米曲霉
米曲霉是曲霉真菌中常见的一个品种，属于霉椒半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，从梗孢科，自身可以分泌多种分解酶和相关合成酶，其中以蛋白酶和淀粉酶最为重要[1]。同时他们也是十分重要的酶制剂，特别是在现代医药，食品酿造和丝绸纺织领域的应用十分广泛[2-3]。属于气生菌丝。培养适温37℃[4]。它生长周期快，观察周期短，把米曲霉提纯后，10天直径可以达到5cm,质地疏松，刚长出来时为白色，随着生长时间变长，慢慢变为黄色，最后变为褐色至淡褐色，菌落大，可以直接观察，用尺子量在培养基上的透明圈进行数据记录分析。由于其具有很高的商业价值，很多企业都利用微生物发酵法大量生产这两种酶制剂[5-7]。 我们则着重研究米曲霉生产蛋白酶。 2材料与方法 2.1实验材料 2.1.1实验仪器
奥特光学BK5000生物显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司）、SW-CJ-2F型双人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司）、LD2X-40KB立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗机械厂），SPX-250BS-II生化实验培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）[8]。 2.1.2菌株
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菌株由老师获得，教我们用涂布平板法，三点接种法分离纯化，获得优良的菌株，进行诱变。 2.1.3培养基
蛋白酶培养基1000ml（初筛）：蛋白酶上层培养基：葡萄糖 0.05%，氯化钠 0.5%，磷酸氢二钾0.05%，磷酸二氢钾 0.05%，酪蛋白 1%，PH7.5。蛋白酶下层培养基：琼脂1.5%。底层6ml，上层7ml培养基含有供其生长所需的所有营养物质：碳源，氮源，能源，生长因子，无机盐等。利用双层培养基更加方面用肉眼看透明光圈，用尺子量。 2.2实验方法 2.2.1试验程序
原始菌株→分离纯化→37℃生化培养箱培养→三点接种→37℃生化培养箱培养→观察结果→紫外诱变→涂布平板法→37℃生化培养箱培养→三点接种→37℃生化培养箱培养→观察结果→微波诱变→37℃生化培养箱培养→三点接种→37℃生化培养箱培养→选择优良菌株。 2.2.2制备菌悬液
合理的菌悬液的制备方法及使用可以保证微生物限度实验操作简便，及时及检验实验结果的可靠性[9]。高压灭菌200~300ml分别装到试管的10ml生理盐水，灭菌后取出，在无菌环境下，用上面筛选好的四个菌株每个分别加入四环到不同试管里，并且标注序号，相互对照。 2.2.3紫外线诱变
采用紫外线诱变方法，由经验可知：致死率达到75%左右时，产生正突变的几率比较高，有利于进一步筛选[10]。根据这个经验，将其置于紫外灯下，在放之前紫外灯要预热1h[11],照射距离为30cm[12],距离分设时间梯度进行诱变，探究哪一个时间梯度更加适合诱变进行，先加盖辐射1min，杀去培养基表面杂菌，再分设时间梯度进行辐射，为期望达到最好效果，黑暗低温对突变株有稳定作用[13]。但是结合上面米曲霉最适生长温度，低温不适合米曲霉，蛋黑暗条件可以满足，实验要在黑暗下进行，用黑纸做个黑箱把磁力搅拌器包住，为了使诱变效果更加
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好，把实验时间安排在晚上，避免其它光线干扰，诱变后的菌液进行涂布，在三十摄氏度下培养，接下来几天观察实验结果。致死率=（对照中的活菌数/ml-照射后的活菌数/ml）/对照中的活菌数/ml。 2.2.3微波诱变
微波的生物效应包括热效应和非热效应，由于这两种效应的存在，从而可以引起生物体产生一系列正突变效应和副突变效应[14]，微波诱变正突变率高，效果好，操作简便，所选育菌株遗传性状稳定[15]， 吸取制得的孢子悬液，注入培养皿里，每个培养皿的量大约为10ml，调微波功率700W，按不同的时间梯度进行辐射，用冰浴法消除微波的热效应[16]，涂布平板法观察培养。 2.3筛选 2.3.1初筛
用三点接种法接种很多米曲霉，放在三十摄氏度生化培养箱里培养，每天早上八点十分左右量取菌的直径，采用酪蛋白平板水解透明圈法进行初筛，分别测定HE值（HE=透明圈直径/菌落直径）[17]，选出HE值大的培养备用，作为接着下紫外诱变的菌种。 2.3.2复筛
经过紫外线及微波辐射后依旧活着的且HE之比增加的米曲霉就是要选用的米曲霉。 3．结果与讨论 3.1出发菌落选定
将放在生化培养箱的四十个培养皿里德菌落每天测量它的透明圈直径D和菌落直径d，连续测量五天，并计算比值，从里面筛选出来比值最大的菌落作为诱变菌落的出发点。实验结果见下表，共选择四个菌落。 菌株 天数 2 一号菌株 3 4 5 2 二号菌株 3 4 5 透明圈直1.1 1.5 1.8 1.5 2.2 3 3 3.2 3.7
菌落直径d 0.7 1.3 1.5 1.9 1.5 2.6 3 D/d 菌株 天数 2 2.8 1.57 1.15 1.2 1.26 1.47 1.15 1.06 1.32 三号菌株 3 4 5 2 四号菌株 3 4 5 透明圈直1.5 1.8 2.5 2.5 1.8 1.5 1.6 2 菌落直径d 0.7 1.5 2 D/d 2 0.4 1.2 1.4 1.5 2.14 1.2 1.25 1.25 4.5 1.25 1.14 1.3 表一 菌落直径和透明圈关系
3.2紫外线诱变
在黑暗中用紫外灯（15W，距离27cm，波长254nm）于磁力搅拌器下分别照射30,45,60,90秒[18]，根据自身实验条件并结合实际情况，先设时间梯度为3min,4min,5min,再确定下次诱变时间。结果如下表。 处理时间 3min 4min 5min
诱变前菌落数 无法计数 无法计数 无法计数
诱变后菌落数 无法计数 无法计数 无法计数
第一次诱变时间结果
根据上面数据发现菌落数死亡率很低，没有达到预期效果。还有大量杂菌污染，因此加大紫外照射时间，来杀死更多米曲霉。青霉素对细菌的细胞壁有高度的选择性，由于细菌的细胞壁与哺乳动物细胞壁不同，所以青霉素对人的毒性很小，而真菌没有细胞壁，故青霉素对真菌无效[19]。加入青霉素，溶解1g青霉素于足量无菌水中，最后定容至10ml分装成小分与-20℃储存，最后以25ug/ml~50ug/ml的终浓度添加于生长培养基里，杀死其他细菌。重复以上步骤，先用2min,4min,6min,8min,10min辐射，实验结果如下表： 处理时间 2min
诱变前菌落无法计数
诱变后菌落无法计数
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处理时间 6min
诱变前菌落无法计数
诱变后菌落35%左右
4min 10min
无法计数 无法计数
50%左右 30%左右
8min
无法计数
20%左右
第二次诱变结果
观察发现杂菌几乎没有，在时间6min,8min,10min梯度内很理想，继续细化时间进行诱变，设置时间梯度为7min,8min,9min,加入抗生素。结果如下：
处理时间 7min 8min 9min
诱变前菌落数 无法计数 无法计数 无法计数
诱变后菌落数 10%左右 20%左右 15%左右
第三次诱变结果
由于时间问题，紫外诱变就做到这儿，如果进行紫外诱变米曲霉最佳时间为7min,8min,9min,照射距离为30cm,并在黑暗条件下进行，此时的米曲霉生长速度最快。对于微波诱变在加入青霉素防止杂菌污染的情况下探究出最适时间为30s,40s,50s。 4展望
米曲霉在生活中利用广泛，有非常大的用处，比如在对米曲霉发酵对豆渣成分影响研究中发现：米曲霉发酵豆渣可以显著改变其营养成分和功能性成分，改善其加工特质[20]。国内外在发酵生产酱油、制酱、酿酒等工业上的应用历史悠久。WH0批准米曲霉1987年，FAO曲霉可用于食品工、用酶制剂的生产。美国环境保护局对米曲霉与其它物种的分类关系、对人类健康和环境的危害和应用的风险性评价结果表明，米曲霉对动植物无致病性。米曲霉发酵所加工的产品及食品对人类或动物具有一定的保健功效，初步研究表明，米曲霉在条叶(尤其普洱茶)渥堆发酵中起着重要的作用。所以，研究米曲霉特性对大力发展轻工业，研发高质量的产品有着广泛的发展前景。 5致谢
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