碘价的测定(Hanus) 法
三、实验原理
在适当条件下，不饱和脂肪酸的不饱和键能与碘、溴或氯起加成反应。脂肪分子中如含有不饱和脂酰基，即能吸收碘。100g脂肪所吸收碘的克数称为碘价。碘价的高低表示脂肪不饱和度的大小。由于碘与脂肪的加成作用很慢，故于Hanus试剂中加入适量溴，使产生溴化碘，再与脂肪作用。将一定量(过量)的溴化碘(Hanus试剂)与脂肪作用后，测定溴化碘剩余量，即可求得脂肪之碘价，本法的反应如下： I2+Br2-->2IBr(Hanus试剂)
IBr+一CH=CH—-->—CHI—CHBr— KI+CH3COOH-->HI+CH3COOK HI+IBr-->HBr+I2
I2+2Na2S2O3-->2Nal+Na2S4O6 (滴定) 四、实验试剂及材料仪器
1、Hanus试剂：溶13.20升华碘于1000ml冰醋酸(99.5％)内，溶时可将冰醋酸分次加入，并置水浴中加热助溶，冷后，加适当之溴(约3ml)使卤素值增高一倍。此溶液储于棕色瓶中。 2、15％碘化钾溶液 称取150g碘化钾溶于水，稀释至1000ml。
3、标准硫代硫酸钠溶液(约0.1N) 25g纯硫代硫酸钠晶体Na2S2O3．5H20溶（C·P以上规格)于经煮沸后冷却的蒸馏水中，稀释至1000ml，此溶液中可加入少量(约50mg)Na2CO3，数日后标化。
标化方法：精密称取在1200C干燥至恒重的基准重铬酸钾0.15—0.20g 2份，分别
置于两个500ml碘瓶中，各加水约30ml使溶解，加入固体碘化钾2.0g及6NHCl l0 ml：混匀，塞好，置暗处3分钟，然后加入水200ml稀释，用Na2S203滴定，当溶液由棕变黄后，加淀粉液3ml，继续滴定至呈淡绿色为止，计算Na2S2O3溶液的准确浓度。滴定的反应：
K2Cr2O7+6I-+14H+—>2K++2Cr3++3I2+7H2O
I2+2S2O2-—>2I-+S4O2-
4、1％淀粉液 五、实验方法
准确称取0.2g脂肪，置于碘瓶(图5中)，加10ml氯仿作溶剂，待脂肪溶解后，加入Hanus试剂20ml，(注意勿使碘液沾在瓶颈部)，塞好碘瓶，轻轻摇动，摇动时亦应避免溶液溅至瓶颈部及塞上，混匀后，置暗处(或用黑布包裹碘瓶)30分钟，于另一碘瓶中置同量试剂，但不加脂肪，作空白试验。
60分钟后，先注少量15％碘化钾溶液于碘瓶口边上，将玻塞稍稍打开，使碘化钾溶液流入瓶内，并继续由瓶口边缘加入碘化钾溶液，共加20ml，再加水100ml，混匀，两个样品一起加入，终止反应。随即用标准硫代硫酸钠溶液滴定。初加硫代硫酸钠溶液时可较快，俟瓶内液体呈淡黄色时。加淀粉液1ml，继续滴定，滴定将近终点时(蓝色已淡)，可加塞振
荡，使与溶于氯仿中之碘完全作用，继续滴定至蓝色恰恰消失为止，记录所用硫代硫酸钠溶液量，用同法滴定空白管。
按下式计算碘价： 碘价=
(B?S)N126.9??100
脂肪重量（g）1000式中 B：滴定空白所耗Na2S2O3溶液毫升数；S：滴定样品所耗Na2S2O3溶液毫升 N： Na2S2O3溶液的当量浓度。 七、实验注意事项
1、油脂加入Hanus试剂后，要将碘瓶的塞子塞好，防止碘挥发，同时在塞子的周围滴上几滴KI，以便将塞子密封，碘瓶一定要放在暗处。
2、在向碘瓶中加KI和水时，一定要先加在塞子的周围，然后打开塞子，使其进入碘瓶中。 3、在进行Na2S2O3滴定时，开始不要加淀粉指示剂，当滴定到颜色变为浅黄色是再加淀粉，当滴定快到终点时，要用力摇碘瓶中的溶液，以便溶解在氯肪中的碘重新溶解在溶液中，否则滴定结果不够准确。
4、本实验需要做样品的两个平行实验，一个空白实验。 五、思考题
1.测定碘值有何意义？
在一定条件下，每100g脂肪所吸收的碘的克数称为该脂肪的“碘值”。碘值越高，表明不饱和脂肪酸的含量越高，它是鉴定和鉴别油脂的一个重要常数。 2.加入IBr后，为何要在暗处放置？
在进行碘值测定过程中需要将其放在暗处，目的是为了防止IBr见光分解。 3.滴定过程中，为何淀粉溶液不能过早加入？
淀粉的螺旋腔可以结合碘，从而使滴定结果变的不准确。
酪蛋白的制备
二、原理
牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。 三、材料、试剂与器具 （一）材料：新鲜牛奶 （一）试剂 1、95%乙醇1 200mL 2、无水乙醚1 200mL 3、0.2mol/L pH4.7醋酸——醋酸钠缓冲液 100ml 先配A液与B液
A液：0.2mol/L醋酸钠溶液 称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000ml。
B液：0.2mol/L醋酸溶液，称优 纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000ml。 取A液1770ml，B液1230ml混合即得Ph4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液3000ml。 4、乙醇——乙醚混合液 乙醇：乙醚=1 ：1（V/V）
（二）器具1、离心机2、抽滤装置3、精密pH试纸或酸度计 4、 电炉5、烧杯6、温度计
四、操作步骤
（一）酪蛋白的粗提
100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液100mL.用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。
将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000 r /min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 （二）酪蛋白的纯化
1、用水洗涤沉淀 3次，离心10分钟（3 000r/min），弃去上清液。2、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。3、将沉淀摊开在表面 上，风干；得酪蛋白纯品。 （三）准确称重，计算含量和得率。
含量：酪蛋白g/100 mL牛乳（g%） 获得率=制备含量/理论含量
式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。 五、注意事项
1、由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质，故调节牛奶液的等电点一定要准确。最好用酸度计测定。
2、精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂，最好在通风橱内操作。
3、目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品，不是纯净牛奶，所以计算时应按产品的相应指标计算。 七、思考题
1、操作方法中的第二步能否用大量水洗涤？为什么？
2、用乙醇、乙醇——乙醚混合液及乙醚洗涤的目的是什么？能否颠倒？
答：不能，经过这个次序以后，结晶吸附的溶剂改为乙醚，乙醚沸点低，容易挥散干净，得到纯的洁净，乙醇和乙醚的溶解性能差很远，乙醇实际上介于水和有机溶剂之间，而乙醚是完全的有机溶剂，他们各自去洗涤各自能溶解的物质，从无机（水）到有机（乙醚），最后用乙醚是因为它会很快挥发掉，不留痕迹，可得到纯粹的蛋白质。
用正交法测定几种因素对酶活力的影响
一．实验原理
酶反应受到多种因素的影响，如底物浓度、酶浓度、温度 pH 值、激活剂和抑制剂等都能影响酶反应速度。这种多因素的试验可通过正交法即用一特制的表格 —— 正交表来安排试验，计算和分析试验结果。这样就能通过少量试验取得较好的效果。实践证明正交法是一个多、快、好、省的方法，目前已广泛用于工、农、医药业生产和科学实验中。
本实验运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度 pH 值达四个因素对酶活性的影响，并求得在什么样的底物浓度、酶浓度、温度和 PH 值时酶的活性最大。通过本实验初步掌握正交法的使用。 二．试剂
1 ． 2 ％血红蛋白液：于 20ml 蒸馏水中加入血红蛋白 2.2 g ；尿素 36 g ， lmol/L NaOH 溶液 8 ml ，室温放 1 小时，使蛋白变性。如有不溶物，可过滤除去。再加 0.2 mol/L NaH 2 PO 4 溶液至 110 ml 及尿素 4 g ，调节溶液 PH 达 7.6 左右。 2 ． 15 ％三氯醋酸溶液： 15g 三氯醋酸溶于蒸馏水，并稀释至 100 ml 。 3 ．牛胰蛋白水解酶液： 3mg 牛胰蛋白水解酶冷冻干粉，溶于 10 ml 蒸馏水。 4 ． 0.lmol/L pH 7 、 8 、 9 巴比妥缓冲液
5 ． Folin- 酚试剂：基础实验中 Folin- 酚试剂法测定蛋白浓度实验 三．操作步骤
1 ．实验设计：本实验取四个因素，即底物浓度 [S] 、酶浓度 [E] 、温度、 pH 值。每个因素选三个水平（水平即在因素的允许变化范围内，要进行试验的 “ 点 ” ）。 因素 水平 （S） （E） 温度 pH 1 2 0.2ml 0.5ml 0.2ml 0.5ml 37℃ 50℃ 7 8 9 3 0.8ml 0.8ml 60℃ 按一般方法，如对四个因素三个水平的各种搭配都要考虑；共需做 3 4 =81 次试验，而用正交表只需做 9 次试验。选用 L 9 表（ L 是正交表的代号， L 右下角的数字表示试验次数）。 L 9 表有两个特性
（ 1 ）每一列中 “1”“2”“3” 这三个数字都出现三次，即它门出现的次数是相同的。 （ 2 ）每两列的横行组成的 “ 数对 ” 共有九个，九种不同的数对（ 1 ， 1 ），（ 1 ， 2 ），（ 1 ， 3 ），（ 2 ， 1 ），（ 2 ， 2 ），（ 2 ， 3 ），（ 3 ， 1 ），（ 3 ， 2 ），
（ 3 ， 3 ）各出现一次。
在每一列中各个不同的数字出现的次数相同；每两列的横行组成的各种不同的 “ 数对 ” 出现的次数也都相同，这两点就是正交表的特点，它保证了用正交表安排的试验计划是均衡搭配的，因此，分析数据比较方便，结果比较可靠。 2 、试验安排： 列号 试验号 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 1 1 1 2 2 2 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 1 2 3 2 3 1 3 1 1 2 3 3 1 2 2 3 1 9 3 3 2 表中试验号共九个，表示要做九次试验，每次试验的条件如每一横行所示。如做第一试验时（S）是0.2ml,(E)是0.2ml，温度37℃，pH为7。第二个试验（S）是0.2ml ,(E)是0.5 ml.温度50℃，pH为8，余此类推。
具体试验条件如表3-2所示 试管1 5 8 2 4 9 3 5 7 号 试剂（ml） 2%血红蛋白液 0.2 0.5 0.8 0.2 0.5 0.8 0.2 0.5 0.8 缓冲液 酶度 PH7 PH8 PH9 PH8 PH9 PH7 PH9 PH7 PH8 2.6 1.7 1.7 2.3 2.3 1.4 2.0 2.0 2.0 37℃保温5分钟 50℃保温5分钟 60℃保温5分钟 0.2 0.8 0.5 0.5 0.2 0.8 0.8 0.5 0.2 37℃反应10分钟 50℃反应10分钟 60℃反应10分钟 各管均加入15%三氯醋酸溶液2ml 终止反应。 另取试管一支作非酶对照，即加 2 ％血红蛋白液 0.5ml ，缓冲液 2.0ml ，先加 15 ％ TCA 2ml 摇匀放置 10 分钟后再加入酶液 0.5ml 。
将上述酶促和非酶对照各管反应液，室温放置 15 分钟，过滤，滤液留待 Folin- 酚法测