郑州大学2009届硕士学位论文构建T G F一印SI R N A真核表达载体并转染A549细胞的初步研究
材料与方法
1.材料
L l细胞
人A549肺癌细胞，购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(C C T c C)
(注:目前国内外尚无可靠来源的人肺成纤维细胞株，只有鼠来源的肌成纤维细胞株，与人肺成纤维细胞起源不同。本实验离体阶段的目标旨在观察SI R N A 对T G F一印的沉默效应，采用的人A549细胞与人肺成纤维细胞株同源自人上皮细胞组织，最大可能的保证了细胞水平实验条件的同一性。)
1.2菌株
大肠杆菌D H S。，大肠杆菌JM109，由郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室保存和提供。
1.3质粒
环形p sil en cer r M2.0一U6表达载体(含氨节青霉素A m Pr抗性基因和人U6启动子)购自A m b i on公司(结构示意图见图1);质粒在感受态细菌大肠杆菌D H5a 菌株中扩增，取自郑州大学医学院微生物与免疫教研室。
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图1p s n en ee产M Z.o一U6表达载体图
(环形p s i l eneer N 2.0一U6表达质粒含有B am H I和H i n dlll酶切位点，具有人U6启动子;
含氨节青霉素A m Pr抗性基因)。
1.4T e F p l发卡样si R N A寡核昔酸(表l )
郑州人学2009届硕士学位论文构建T G F 一p l si RN A 真核表达载体并转染A 549细胞的初步研究粒含有B am H I 和Hi n dln 酶切位点(结构示意图见图l)，分别用B am H I 、Hi nd 川双酶切载体，得到开环p sil en cer r M 2.0一U 6载体形成线性化片段，并除去酶切下来的小片段而纯化，使其不会发生自身连接。反应体系如下:10x B uff e r 4.5川，B am H I 酶2.25林l，H i ndl ll酶2.25林l，p s即二eo 质粒36林l;反应条件:37oC 水浴中反应2小时、70℃水浴中灭活5分钟，用1 .5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2.5.5酶切产物电泳胶回收:真核表达载体PS il ence产M 2.0一U 6双酶切后回收双粘质粒大片段。在凝胶成像系统长波紫外灯下切下含线性化p sil en cerTM 2.0一U 6的凝胶，胶回收采用德国Q I A G EN 公司D N A 胶回收纯化试剂盒的步骤进行，然后电泳鉴定。方法同2.4.2。
2.5.6连接反应:按比例充分混匀连接体系后放入两个1 .sm L eP 管中(见表5及图2)，同时配一个线性载体与超纯水的连接体系做为对照，室温16℃水浴反应过夜。
表5连接反应体系
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图2 p s i l en ee产M 2.0一U 6重组质粒图谱