第一章
1、 植物组织培养： 是指在离体条件下，利用人工培养基对植物的器官、组织、细胞、原 生质体等进行培养，使其长成完整植株
2、外植体：在植物组织培养中，由活体（in vivo）植物上提取下来的、接种在培养基上的
无菌细胞、组织、器官等均称为外植体。
3、愈伤组织：指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。 4、应用
一、农业上的应用
1. 种苗快速繁殖 (rapid propagation) 2.无病毒苗(virus free)的培养 3.在育种上的应用(breeding)
（1）倍性育种，缩短育种年限，杂种优势明显； （2）克服远缘杂交的不亲合性和不孕性（胚培养）； （3）保存种质 （4）创造变异
二、在遗传学、分子生物学、细胞生物学、组织学、 胚胎学、基因工程、生物工程等方面的应用。用于基因工程技术创造植物新种质。用于植物生长发育理论研究，包括生理学、病理学、胚胎学和细胞与分子生物学等。
三、利用组织培养材料作为植物生物反应器
第二章
1、细胞全能性（Totipotency）：指任何具有完整的细胞核的植物细胞都拥有形成一个完整植
株所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。
2、细胞分化（cell differentiation）：指导致细胞形成不同结构，引起功能或潜在的发育方式
改变的过程。
3、脱分化（Dedifferentiation）：指离体条件下生长的细胞、组织或器官逐渐失去原来的结构
和功能而恢复分生状态，形成无组织结构细胞团或愈伤组织的过程。
4、再分化（Redifferentiation）：指脱分化的细胞重新恢复分化能力，形成具有特定结构和功
能的细胞、组织、器官甚至植株的过程。
5、植物组织培养中常遇到的问题以及解决措施
一 、污染及防治：
1、真菌污染后，如果已形成孢子，则必须经高压灭菌后扔掉。但若是细菌污染，只要及时发现，将材料上部未感菌的部分剪下转接，材料仍可使用。 2、用抗生素等杀菌药剂的处理，会影响植物材料正常生长。 二、褐变及防止
（1）选择合适的外植体
（2）合适的培养条件 （3）使用抗氧化剂 （4）连续转移
三、玻璃化问题及其防止
（1）增加培养基溶质水平，降低培养基水势； （2）减少培养基含氮化合物用量； （3）增加光照；
（4）增加容器通风，进行CO2施肥，对减轻试管苗玻璃化现象有明显作用； （5）降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化现象发生； （6）降低培养基细胞分裂素含量，加入适量脱落酸。 四、其他问题和解决措施 （一）初始培养阶段：
1、培养物水浸状、变色、坏死、茎断面干枯
改进措施：调换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间；试用其他部位，生长初期取材。
2、长期培养培养物几乎无反应
改进措施：更换基本培养基或调整培养基成分，尤其是调整盐离子浓度，增加生长素用量，试用2,4-D，调整培养温度。 3、愈伤组织生长过旺、疏松，后期水浸状
改进措施：减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐（尤其是铵盐）含量，适当提高琼脂用量增加培养基硬度。
4、愈伤组织太紧密、平滑或突起，粗厚，生长缓慢
改进措施：减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长素比例，降低糖浓度。 5、侧芽不萌发，皮层过于膨大，皮孔长出愈伤组织 改进措施：减少激素用量，采用较老化枝条。
（二）继代培养阶段
1、苗分化量少、速度慢、分枝少、个别苗细高
改进措施：增加细胞分裂素，降低温度，改善光照，改单芽继代为团块（丛芽）
继代。
2、苗分化过多，生长慢，畸形，节间极短，苗丛密集，微型化 改进措施：减少或停用细胞分裂素一段时间，调节温度。
3、分化率低，畸形，培养时间长时苗再次愈伤组织化 改进措施：减少生长素用量，适当降温。 4、叶粗厚变脆
改进措施：减少激素用量，避免叶片接触培养基。 5、再生苗的叶缘、叶面等处偶有不定芽分化出来
改进措施：适当减少细胞分裂素，或分阶段地利用这一再生方式。 6、丛生苗过于细弱，不适于生根或移栽
改进措施：减少细胞分裂素，免用赤霉素，延长光照时间，增强光照，及时转
接，降低接种密度。
7、幼苗淡绿，部分失绿
改进措施：针对营养元素亏缺情况调整培养基，调好PH值，调控温度、光照。 8、幼苗生长无力、发黄落叶、有黄叶、死苗夹于丛生苗中
改进措施：及时转接、降低密度，调整激素配比和营养元素浓度，改善瓶内气
体状况，控制温度。 （三）生根阶段
1、久不生根，基部切口无适宜愈伤组织
改进措施：选用适宜的生长素或增加生长素用量，适当降低无机盐浓度。 2、愈伤组织生长过快、过大，根茎部肿胀或畸形，几条根并联或愈合。
改进措施：调换生长素种类或几种生长素配合使用，降低浓度，附加VB2或PG等减少愈伤等。
6、操作技术 一、洗涤技术
1、玻璃器皿洗涤 新购置玻璃已用过的玻2、塑料用品洗涤 1%稀HCl 浸渍12h 清水晾干 洗衣粉新的塑料器皿打开即用 已用过的塑料
2%NaOH浸泡
12h 蒸馏水冲
清水
2%—5%盐酸浸泡30min
清水冲
晾干备用 3、金属用品洗涤
热洗衣粉水洗净
冲洗 擦干
二、灭菌技术 1、灭菌
（1）培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法
（2）玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌干热消毒灭菌。 （3）塑料器皿灭菌：多采用高压蒸汽消毒灭菌；
（4）金属用具灭菌：灼烧灭菌；浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用。
（5）接种室灭菌
接种室→紫外灯照射→空气消毒灭菌
超净工作台→紫外灯照射、70%—75%的酒精擦洗→培养材料的接种 （6）外植体灭菌
流水冲洗10—20min或更长时间→70%—75%酒精中浸泡30s→0.1%—0.2%氯化汞液中浸泡10min左右、在10%的次氯酸钠、饱和漂白粉浸泡30min左右→蒸馏水冲洗4—5次→备用
第三章
1、植物营养器官：植物器官培养（Organ culture）是指对植物某一器官的全部或部分或器官
原基进行离体培养的技术。
2、组织培养：组织培养（Tissue culture）是指对植物愈伤组织等进行离体培养的技术。 3、植物器官和组织培养的基本程序
一、无菌外植体的获得 二、初代培养物的建立 三、形态发生和植株再生 四、培养产物的观察记载 五、诱导生根和再生植株移栽 4、形态建成方式
⑴不定芽途径
⑵腋芽增殖（侧芽增殖）途径 ⑶原球茎途径 ⑷胚状体途径
5、根、茎、叶培养的意义
1、根培养意义
◆研究根系生理代谢的最优良试验体系。 ◆研究器官分化、形态建成的良好体系。
◆建立快速生长的根无性系，对药物生产有重要意义。
◆对根细胞培养物进行诱变处理，可筛选突变体，用于育种实践。 2、茎培养意义
? 无性系快速繁殖；
? 培养无病毒苗，品种改良； ? 理论基础研究。 3、叶培养意义
研究叶形态发生以及光合作用、叶绿素形成、遗传转化研究。
第四章
1、植物胚培养（Embryo Culture）：指对植物的胚、胚乳、子房和胚珠进行离体培养，使其
发育成完整植物的技术。
2、胚培养的发育途径
? 按正常胚胎发育途径形成植株 ? 脱分化形成愈伤组织 ? 胚“早熟萌发” 3、胚培养的意义
1、克服远缘杂交不亲和性
利用“胚胎拯救（Embryo rescue）”技术获得远缘杂种； 2、打破种子休眠，缩短育种周期；
3、提高种子萌发率；特别是对于一些长期营养繁殖植物的种子
4、胚乳培养的意义
? 胚乳培养再生植株证明了全能性理论； ? 研究胚和胚乳的关系及胚乳组织的功能；
? 获得三倍体植株，用于育种利用。三倍体植株具有营养体大，无籽等特点。如无籽
西瓜、葡萄、香蕉。
? 胚乳培养也会产生较多的混倍体，影响育种利用。但可用于染色体工程研究。 ? 胚乳细胞是研究淀粉、蛋白质和脂类天然产物代谢途径的理想系统。 5、胚“早熟萌发”：幼胚在培养基不能长出成熟胚的各种结构，越过正常胚胎发生若干阶段，
直接长成幼苗。
6、离体授粉（pollination in vitro）：指将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌
培养，并以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术。
7、离体授粉的意义
可以克服远缘杂交中的不亲和性，特别是离体子房授粉和离体胚珠授粉，能消除柱头和花柱所造成的受精前障碍。
8、花粉培养：是将花粉从花药中分离出来进行离体培养的过程。
9、花药培养：把发育到一定阶段的花药，通过无菌操作技术，接种在人工培养基上，以改
变花药内花粉粒的发育程序，诱导其分化成完整植株的过程。
10、花药培养过程
1. 取材：多数植物以单核靠边期为宜 2. 灭菌及预处理 未开放花蕾，常规灭菌后直接取出花药在4~5℃条件下冷处理2~4d，易产生胚状体。 3. 接种
尽量不损伤花药并去除花丝，排除二倍体组织对单倍体植株再生的影响。 4. 培养
常用MS、B5、Nitsch、White等培养基，3~8周后形成胚状体或愈伤。先暗培养，再转至2000lx/14h光照下促分化。
11、花粉花药培养的应用
1、诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期；常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。
2、有利于筛选隐性突变体，提高选择效率; 3、有利于隐性基因控制性状的选择； 4、快速获得自交系的超雄株。
第五章
1、单细胞培养方法 1、看护培养法 2、微室培养法 3、平板培养法
2、细胞悬浮培养的意义：
3、细胞培养的应用
1、植物次生代谢产物的生产 2、突变体选择 3、诱导多变体 4、原生质体培养意义
1、原生质体无细胞壁，有利于细胞融合、体细胞杂交。
2、原生质体容易摄取外来遗传物质，可作为理想的受体系统。 5、原生质体培养方法以及融合方法 原生质体培养方法：
1、 液体浅层培养 2、 固体双层培养 3、 固体平板培养 4、 琼脂糖珠培养 5、 双层滤纸植板培养 融合法：
（1）无机盐诱导融合
（2）高pH—高钙离子融合 （3）聚乙二醇融合法 （4）电融合技术
6、单倍体植物：细胞中仅含配子染色体的植物。 7、细胞培养：指从体内取出组织，分离细胞，或使用细胞系，在体外模拟体内生理环境， 在 无菌、适当温度和一定的营养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能特性。 8、超低温保存：将细胞等置于液氮中保存，解冻后仍能存活的技术。
9、种质保存：指在天然或人工创造的适宜环境条件下，贮存植物种质，使其保持生命力与
遗传性的技术。
10、植物离体繁殖：指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其在短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。
11、原生质体：指脱去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。
12、原生质体融合：指不同种类的原生质体，不经过有性阶段在人工控制条件下，相互融合成一体，形成杂种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术。
第六章
1、植物离体繁殖与传统营养繁殖的优缺点
? 繁殖效率高，生长速度快； ? 培养条件可控制性强； ? 占用空间小；
? 管理方便，利于自动化控制； ? 便于种质交换和保存。
2、快繁器官再生类型
? 短枝发生型 ? 丛生芽发生型 ? 不定芽发生型 ? 胚状体发生型 ? 原球茎发生型
3、快繁程序以及影响因素 程序：
a) 无菌（或初代）培养的建立 b) 繁殖体增殖 c) 芽苗生根
d) 小植株的移栽驯化 影响因素：
? 外植体 ? 培养基 ? 培养条件 ? 继代培养 ? 移栽
4、商业化生产应注意的问题 1污染 ○
污染来源：培养基及器具、器皿污染；外植体灭菌不彻底；操作原因；环境原因等 污染控制：灭菌彻底；操作正确；保持操作区环境清洁无菌。 2遗传稳定性 ○
影响遗传稳定性因素：基因型；继代次数；器官发生方式。
降低遗传变异措施：选用合适的基因型；减少继代次数；采用合适的器官发生方式；减少生长调节剂的使用浓度。 3玻璃化： ○
发生原因：琼脂和蔗糖浓度偏低；培养温度偏高；细胞分裂素浓度偏高；乙烯的影响；光照偏弱；培养基含量偏高等因素。
防止措施：提高培养基硬度；降低培养基水势；提高蔗糖含量；增加培养瓶气体交换，降低湿度；增加光照，降低温度等。 4褐化： ○
培养材料中酚类物质被氧化形成。
影响因素：植物种类和品种（如木本比草本更易褐化）；外植体年龄和取材时间；外植体损伤程度；光温因素；培养基成分。
第七章
1、脱毒机理以及脱毒方法 1、热处理脱毒法：
原理：①热处理能钝化病毒活性，使病毒增殖减缓或停止，失去侵染能力；
②同时加速植物细胞分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。
2、微体嫁接离体培养脱毒法：
原理：把极小（小于0.2mm）的茎尖 作为接穗接到实生砧木上（无菌种子培养获无
菌苗，种子实生苗不带毒），然后将嫁接后的砧木接 种到新的培养基上培养。
3、微茎尖培养脱毒法：
原理：① 病毒在植物体内分布不均匀，越接近顶端分生组 织，病毒浓度越稀。
2 病毒DNA分子与细胞分裂蛋白质合成竞争，在迅速合成的植物细胞中正 ○
常合成的蛋白质占优势。
4、珠心组织培养脱毒法：
原理：病毒通过维管组织传播，而珠心组织与维管组织无直接联系，故可获得无病毒
植株。已用该法去除了柑橘银屑病、叶脉突出病、柑橘裂皮病、速衰病等病毒
5、愈伤组织培养脱毒法：
原理：在同一感病的组织内，存在不感染病毒的 细胞群落，这些无毒的细胞通过殖 产生无病毒组织。
2、常见脱毒植株的检测方法
a) 直接观察 b) 血清鉴定法 c) 电镜鉴定法 d) 生物鉴定法 e) 分子检测法
第八章
1、超低温保存种质资源原理和一般程序
1细胞冰冻结冰保护性脱水理论 原理： ○
2溶液的玻璃化理论 ○
程序：1、植物材料（培养物）的选取
2、材料的预处理
3、降温冷冻及超低温保存
4、解冻：分快速解冻、慢速解冻 5、再培养
6、超低温保存后细胞或组织活力检测
2、限制生长保存种质资源方式 1)高渗保存法
2)生长抑制剂保存法 3)抑制生长的其他保存法
低压保存法：降低培养材料周围气压，达到抑制生长的目的，分为低气压与低氧压两
种，保存原理相似。
饥饿法：从培养基中减去1~2种营养元素，使植株缺乏相关营养而处于最小生长量 干燥保存法：减少培养材料的含水量
矿物油覆盖法：使培养材料与空气隔绝，延缓生长
低光照培养：适当减弱光照强度，缩短光照时间，进而减缓试管苗生长
PPT思考题合集
1、植物细胞全能性：指任何具有完整的细胞核的植物细胞都拥有形成一个完整植株所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。
2、细胞分化：指导致细胞形成不同结构，引起功能或潜在的发育方式改变的过程。
3、脱分化：指离体条件下生长的细胞、组织或器官逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构细胞团或愈伤组织的过程。
4、再分化：指脱分化的细胞重新恢复分化能力，形成具有特定结构和功能的细胞、组织、器官甚至植株的过程。 5、植物离体培养中再生植株有哪些途径？
根、茎或芽器官的发生可使植株重建。先诱导分化出芽，后形成根较好。（还有先根后芽，先愈伤再根芽）
离体培养中再生植株的主要途径有：器官发生；器官型（直接由外植体的细胞形成器官原基），器官发生型（外植体先形成愈伤组织，再产生器官原基）胚胎发生（与合子胚的发生过程类似，体细胞胚在形态和生化水平上和合子胚都相似）
6、愈伤组织是如何形成与生长的？
在细胞脱分化过程中，大多数情况下形成愈伤组织。愈伤组织的细胞往往是异质性的，无明显极性，其形成过程可分为诱导期、分裂期和分化期。 诱导期（起动期）：是细胞准备分裂的时期。细胞大小几不变，内部发生生理生化变化，迅速合成蛋白质和核酸。
分裂期：外层细胞分裂，中间细胞常不分裂，形成小芯。细胞分裂快，结构疏松，缺少结构，浅而透明。在原培养基上，细胞必分化，及时转移，其可无限制地进行细胞分裂，维持不分化状态。
分化期：细胞在形态和生理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞。 生长：诱导期后，外植体外层细胞分裂，在组织受伤表面形成一层愈伤组织，细胞数目迅速增多，表层细胞平均重量下降，体积变小；降低温度，可以使细胞生长速度减慢，平均大小可增加。质地类型：松脆和致密两种。高浓度生长素，可使Callus变得松脆；高浓度细胞分裂素，则可使致密。生理生化变化：次生物质合成能力变化，对激素的需求变化等。 7、植物体细胞胚胎发生有哪些途径？
直接途径：指从外植体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎，如子叶、花序、珠心等外植体。
间接途径: 外植体先脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织的某些细胞重新“决定”为胚性细胞，进而分化出体细胞胚胎。多数体细胞胚胎通过该途径形成的。 通常包括2个阶段：（1）胚胎发生丛（Embryogenic clump）EC是由液泡小、细胞质浓的小细胞构成。
（2）胚状体的发育。将EC转入降低或除去生长素、降低还
原氮的培养基上培养即可。
8、影响植物离体形态发生的因素有哪些？ 一、植物种类和基因型
1、植物种类不同难易程度不同；被子植物比裸子植物容易。 2、同一物种不同基因型间存在较大差别。 二、培养材料的生理状态
1、发育年龄：一般幼态比老态组织形态发生能力高； 2、培养器官或组织类型：细胞分裂旺盛的器官较好；
3、培养时间和细胞倍性：一般取处于旺盛生长期的愈伤来诱导器官形成。 三、培养基
1、营养成分
一般认为，培养基中的铵态氮和K+有利于胚状体形成，提高无机磷的含量可促进器官发生。茎尖培养和芽诱导培养基主要是MS及其修改的培养和B5培养基。茎尖培养的起始培养基和芽增殖的培养基往往是不同。碳水化合物种类及浓度对胚状体发育有重要作用。缺糖或低糖无法形成胚状体。 2、植物激素及生长调节剂（起主导作用，通过影响内源激素的平衡起作用） （1）生长素：促进外植体生长、生根，并与细胞分裂素共同诱导不定芽分化及侧芽萌发与生长。2，4 –D诱导体细胞胚胎发生。
（2）细胞分裂素：促进分化和芽形成，抑制根发育及衰老。 （3）赤霉素：GA3促进茎的伸长，打破休眠，对芽的诱导和形成有促进作用。 （4）乙烯：对芽的诱导和形成有促进或抑制作用
（5）脱落酸：对体胚的发生及成熟很重要，可增加胚性愈伤组织的形成和体胚发生。
3、培养基的性质
（1）愈伤组织诱导：在固体培养基上（胡萝卜、石刁柏） （2）细胞和胚状体的诱导：在液体培养基上。
（3）诱导胚状体或早期胚状体培养：渗透压，要求高 四、培养条件
1、光照培养条件下，光照的作用是影响细胞的状态，而不是光合作用。连续光照有利于培养细胞维管组织的形成。昼夜光照有利于极性的建立及形态发生。光强一般要求1000-5000lx。植物间有所差别。光照周期为10~16h/日。不同波长光质作用不同，蓝光有利于芽的分化，红光有利于根系发生。
2、温度：大多数培养温度为25±2℃. 花药培养低温或高温预备处理。 3、气体：氧气、二氧化碳以及乙烯等气体的浓度和通气状况。
9、常用的灭菌方法有哪几种？
1物理方法：物理灭菌干热、湿热、射线处理、物理除菌、过滤、离心、沉淀等。 ○
2化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌。 ○
10、接种材料如何进行消毒处理？
第一，把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分 钟至数小时，洗时可加入洗衣粉清洗。
第二，要在超净台用70%-75%酒精浸10-30s。
第三，用灭菌剂0.1%升汞处理5-10 min。升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的； 第四，用无菌水涮洗4-6次，每次不少于3min，以尽量去除残毒。 11、组织培养中如何尽量避免出现污染？
1、把组培中所用到的器具洗干净和彻底消毒 2、不用过期的母液作为培养基 3、要对培养基进行湿热灭菌处理
4、接种室要配备空气过滤器或者安装紫外灯 5、培养室要进行定期的消毒
12、离体茎尖经培养后将会出现怎样的培养反应
生长太慢、生长过旺，愈伤增多、生长正常
13、植物器官和组织培养的基本程序是什么？如何获得无菌培养材料？
一、无菌外植体的获得 二、初代培养物的建立
三、形态发生和植株再生
四、培养产物的观察记载，清洗外植体，利用灭菌剂对外植体灭菌，无菌水冲洗3到5次。
14、为什么幼胚培养比成熟胚培养要求的培养基和培养条件更为严格？
由于成熟胚生长不依赖胚乳的贮藏营养，只要提供合适的生长条件及打破休眠，它就可以在比较简单的培养基上萌发生长，形成幼苗。幼胚对营养物质的需求较成熟胚复杂，以保证离体幼胚能沿着胚胎发生的途径发育。
15、比较胚培养、胚珠培养和子房培养的异同。 （1）胚珠培养在人工控制的条件下，对胚珠进行离体培养使其生长发育形成幼苗的技术。 由于幼胚分离难度大，而胚珠分离则相对容易，在幼胚培养时常采用胚珠培养。分为两种类型：受精胚珠培养与未受精胚珠培养防止杂种胚早期败育，获得杂种植株；受精前胚珠培养， 可作为试管受精的基础；未受精胚珠培养，能培养获得单倍体植株，用于单倍体育种。 （2）较胚培养分为成熟胚培养和幼胚培养两种其中成熟胚为子叶期以后的胚，其在简单的培养基上即可萌发生长。对营养条件要求不严格。对发育早期的胚进行培养。培养技术和条件要求较高。其作用为克服远缘杂交不亲和性，打破种子休眠，缩短育种周期，提高种子萌发率 （3）子房培养包括授粉子房和未授粉子房培养授粉子房培养形成成熟果实和种子未授粉子房培养形成小的无籽果实。其作用为获得杂种植株；未授精子房培养为试管受精提供技术基础；未受精子房培养能获得获得单倍体植株，用于单倍体育种。 16、胚胎培养在育种工作中有哪些应用？
1、克服远缘杂交不亲和性；如利用“胚胎拯救（Embryo rescue）”技术获得远缘杂种。 2、打破种子休眠，缩短育种周期
3、提高种子萌发率；特别是对于一些长期营养繁殖的植物种子。 17、离体授粉的意义主要表现在哪些方面？
可以克服远缘杂交中的不亲和性，特别是离体子房授粉和离体胚珠授粉，能消除柱头和花柱所造成的受精前障碍。 18、花药培养的意义
缩短了育种周期，为新品种的选育开辟了新途径。 19、花药培养方法。
平板培养；液体培养；双层培养；看护培养；微室培养；条件培养基培养。 20、简述单倍体育种的用途。 （一）遗传应用
数量遗传研究，创制非整倍体材料，突变体筛选,遗传转化。 （二）育种学应用
1. 缩短育种年限：单倍体加倍形成纯合二倍体；
2. 提高选择效率：加倍后纯合二倍体其等位基因相同，没有显隐性基因相互遮盖； 3. 获得纯雄株等特殊育种材料； 4. 选育自交系。
21、细胞培养方法有哪些？其特点是什么？
方法：看护培养；微室培养；平板培养 （1）看护培养法是指用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。
特点：①简便易行。
②效果好，易于成功。
③不能在显微镜下直接观察细胞生长过程。
（2）微室培养：即将细胞培养在很少量的培养基中。
特点：在培养过程中可连续进行显微观察，将一个细胞的生长、分裂和形成细胞
团的全部过程记录下来。
（3）平板培养法是把单细胞悬浮液与融化的琼脂培养基均匀混合，平铺一薄层在培养基底上的培养方法。
特点：可以定点观察；分离单细胞系比液体浅层培养容易；培养细胞气体交换不
畅。
22、如何测定培养细胞的活力？
1、TTC法
2、荧光素二乙酸法（FDA法） 3、伊凡蓝染色法
23、FDA测活力的原理是什么？
? FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以自由出入细胞膜。 ? 在活细胞中，FDA被酯酶裂解，释放出有极性的荧光素。 ? 荧光素不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。 ? 荧光素在死细胞中不能积累。
? 在UV照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧光
24、如何获得同步化培养细胞？
①体积选择法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。
②饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。
③抑制法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期的同步化细胞。 ④低温法：冷处理也可提高培养体系中细胞同步化程度。 25、影响细胞培养因素？
1、培养基成分：
N6，MS，B5适合单子叶植物细胞培养，
MS，B5，LS，SL适合双子叶植物细胞培养。 条件培养基适合单细胞和低密度细胞培养。 需要硝态氮、铵态氮、无机磷浓度更高。
2、细胞密度：培养基的成分和起始细胞密度对单细胞培养成败有影响。
起始密度：细胞培养最低的有效密度，即能使细胞分裂、增殖的最低接种量，低于这个密度细胞不能分裂，甚至很快解体死亡。
3、植物生长调节剂：细胞悬浮培养时，常表现一种自然的聚集现象，加入2,4-D，少量水解酶或酵母提取液，能增加细胞分散度。 4、PH和CO2浓度
加入EDTA使铁和其他金属离子长期处于可利用状态。在悬浮培养时，PH变动相当大。硝态氮和铵态氮之间进行调整可作为稳定PH的一种方法。二氧化碳对细胞培养无太大影响，但在低密度细胞培养中，二氧化碳对于诱导细胞分裂可能有重要作用。 26. 细胞悬浮培养
使离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养。 27、成批培养
指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，当培养物增殖到一定量时，转接继代，建立起单细胞培养物。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。 28、连续培养
利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种方式。在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持其恒定体积的培养。
27、说明原生质体分离中机械分离法和酶分离法的特点。
机械分离法：排除酶对原生质体结构和代谢活性的影响。方法繁琐；原生质体产量低；高度质壁分离，损害细胞。
酶分离法：条件温和、原生质体完整性好、活力高、得率高。 28、原生质体纯化方法有哪些？原生质体活力的测定方法有哪些？
纯化方法：（1）过滤离心法：采用40-100um网筛过滤收集细胞，低速离心收集沉淀，重复3-4次，可得到原生质体。
（2）漂浮法：原生质体比重小，在一定渗透溶液(如25%蔗糖溶液)中漂浮，吸管收集。
（3）界面法
活力测定：（1）形态识别：形态完整，细胞质饱满，颜色新鲜即为存活原生质体。
（2）染色识别：用0.1%酚番红或Evans蓝进行染色。活力细胞不被染色，
死细胞被染色。
29、简述原生质体培养方法及特点。
固体平板培养法；液体浅层培养法；固液双层培养法；琼脂糖珠培养；双层滤纸植板培养。
30、原生质体融合有哪几种方法？
融合法
（1）无机盐诱导融合
采用NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2、NaCl、CaCl2、葡萄糖硫酸钠、葡萄糖硫酸钾等无机盐进行诱导。应用最早的融合法，但由于异核体形成率低，且对细胞有毒害，目前已不太应用。
（2）高pH—高钙离子融合
0.05 mol/L CaCl2.2H2O，pH9.5-10.5，可使质膜表面特性发生改变，发生融合。
由于异核体形成率低，且对细胞有毒害，目前已不太应用。
（3）聚乙二醇融合法
融合原理：短时间内，细胞质膜粘连，形成细胞质桥，进行融合。
32、试述植物快繁的全过程及影响因素。
过程：无菌（或初代）培养的建立→繁殖体增→芽苗生根→小植株的移栽驯化 影响因素：外植体、培养基、培养条件、继代培养、移栽
34、植物快繁的器官发生类型有哪些？
1短枝发生型 ○
2丛生芽发生型 ○
3不定芽发生型 ○
4胚状体发生型 ○
5原球茎发生型 ○
36、植物离体繁殖商业化生产中应注意哪些问题？
1污染 ○
污染来源：培养基及器具、器皿污染；外植体灭菌不彻底；操作原因；环境原因等 污染控制：灭菌彻底；操作正确；保持操作区环境清洁无菌。 2遗传稳定性 ○
影响遗传稳定性因素：基因型；继代次数；器官发生方式。
降低遗传变异措施：选用合适的基因型；减少继代次数；采用合适的器官发生方式；减少生长调节剂的使用浓度。 3玻璃化： ○
发生原因：琼脂和蔗糖浓度偏低；培养温度偏高；细胞分裂素浓度偏高；乙烯的影响；光照偏弱；培养基含量偏高等因素。
防止措施：提高培养基硬度；降低培养基水势；提高蔗糖含量；增加培养瓶气体交换，降低湿度；增加光照，降低温度等。 4褐化： ○
培养材料中酚类物质被氧化形成。
影响因素：植物种类和品种（如木本比草本更易褐化）；外植体年龄和取材时间；外植体损伤程度；光温因素；培养基成分。
37、种质资源保存：指在天然或人工创造的适宜环境条件下，贮存植物种质，使其保持生命
力与遗传性的技术。
38、超低温保存：将细胞等置于液氮中保存，解冻后仍能存活的技术。 39、超低温保存离体种质资源的原理和一般程序是什么？
1细胞冰冻结冰保护性脱水理论 原理： ○
2溶液的玻璃化理论 ○
程序：1、植物材料（培养物）的选取
2、材料的预处理
3、降温冷冻及超低温保存
4、解冻：分快速解冻、慢速解冻 5、再培养
6、超低温保存后细胞或组织活力检测
40、限制生长保存离体种质资源有哪些方式？ 1)高渗保存法
2)生长抑制剂保存法 3)抑制生长的其他保存法
低压保存法：降低培养材料周围气压，达到抑制生长的目的，分为低气压与低氧压两
种，保存原理相似。
饥饿法：从培养基中减去1~2种营养元素，使植株缺乏相关营养而处于最小生长量 干燥保存法：减少培养材料的含水量
矿物油覆盖法：使培养材料与空气隔绝，延缓生长
低光照培养：适当减弱光照强度，缩短光照时间，进而减缓试管苗生长
2015年6月21日星期日 谢建明 于19#503