枇杷叶内生菌菌种内细菌的分离培养与鉴定
[摘要]
目的：对3种不同来源的枇杷叶中内生菌进行培养与鉴定。
方法：将枇杷叶削除表皮，研钵研碎后获得组织提取液，用稀释法对叶内生菌中的细菌进行培养，最后单染色法对细菌进行染色，用显微观察法对细菌进行观察。
结果：培养皿中菌落形态各自呈现出不同特征。
结论：枇杷叶内生菌中不同细菌的种群、数量存在显著差异。 [关键字]枇杷 内生菌 多样性 1 引言:
枇杷：属蔷薇科枇杷属植物，其花、果、叶和根均可入药，具有清肺，降气化痰的功效。果实风味甘酸、性凉，具有清肺、润肺、宁嗽、止咳、合胃、止渴、下气、止吐逆、主上焦热和润五肺之功效。国内已开发出强力枇杷露等多种枇杷制剂，因枇杷具有多种功效，广泛应用于临床用药。因此，我们对枇杷内生细菌进行了培养、菌株分离等初步研究。 2 实验部分： 2.1 材料
新鲜翠绿枇杷叶数片（采自浙江理工大学下沙校区百草园4棵不同枇杷树上）。原植物经鉴定为枇杷牛肉膏蛋白胨固体培养基（用于培养）、牛肉膏蛋白胨固体培养基+制霉菌素（用于筛选细菌）。 2.2 操作方法：
2.2.1 内生细菌的分离：用自来水将新鲜植物表面洗净，于1000ml 95%酒精中浸泡3-5min，后无菌水冲洗3-4次，至于超净台备用。用研钵将枇杷叶碾碎，加入适量无菌水，后用1ml移液器吸取原液10ml于空带盖试管中，标号①。用稀释法分别将原液稀释成10^-1~10^-5倍于已装有9ml无菌水试管中配成10ml溶液，分别标号②~⑥，获得梯度样液，至于超净台中备用。在超净台中将上述6管样液用200ul移液器各移取200ul至已倒好的6个平板中，酒精灯旁分别涂布，对应编号，标记稀释倍数、日期、组别，于26℃培养箱中倒置培养3~5天。 2.2.2 内生细菌的鉴定：对培养皿中分离所得的细菌分别挑取5个菌斑，采用单染色法分别对菌斑染色，后对染色后的细菌进行显微形态特征的观察、鉴定。 2.3 操作过程： 2.3.1 制样液
（1）在超净台上,用研钵将早期置于其中的枇杷叶研碎,用无菌水溶解,纱布过滤,得到样液备用。
（2）用1ml移液器从装有样液的烧杯中吸取1mL注入已装有9mL无菌水的试管中,充分混匀,编号②。后用1ml移液器从②号试管中吸取1mL样液注入另一装有9mL无菌水的试管中,编号②。以此类推分别制成10^-3~10^-5倍稀释度的各种样液，分别编号③~⑥。
2.3.2 涂布平板法分离微生物
(1) 倒平板:将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基冷却至55-60OC时,向其中加入制霉菌素0.6mL(50ug/mL),倒平板.
方法:右手持盛有培养基的锥形瓶,置火焰旁5cm~10cm内, 左手用手掌边缘和
小指控制培养皿,锥形瓶口在火焰上灭菌,后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝,迅速倒入培养基约15mL,加盖后平置于台面上,待冷凝后即成平板.
(2) 涂布:将培养基分别用记号笔写上1~10^-56种稀释度,后用200ul移液器分别从10^-1, 10^-2 , 10^-3, 10^-4,10^-5的稀释液中取200uL对号放入已写好稀释度的平板中,后再吸取原液0.2ml于编号1倍的培养基中。用无菌玻璃涂布棒在培养基表面轻轻地涂布均匀.
(3) 培养:将牛肉膏蛋白胨平板于26OC培养箱中倒置培养3~5日.
2.3.3 观察:几天后进行观察记录,并将分离所得的细菌用单染色法染色后镜检.
细菌的单染色法：
1、 涂片：取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，
用无菌操作分别挑取培养所得细菌于载玻片的生理盐水中涂抹，使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜（每一种菌制一片）
2、 干燥：于室温中自然干燥。
3、 固定：涂片面向上，于火焰上通过2—3次，使细胞质凝固，以固
定细菌的形态，并使其不易脱落。
4、 染色：水平放置玻片，滴加染色液于涂片薄膜上，番红染色液染色
1—2分钟。
5、 水洗：倾去染液，自来水冲洗。用吸水纸吸取多余水分，自然干燥。
2.4 结果观察：
2.4.1 3天后：5个培养基中,编号10^-1培养基中长有单菌落，菌落呈现出小,黄色,湿润,圆形,隆起,不透明,边缘整齐等特点，而其余培养基均无菌生成；1星期后：5个培养基中,编号10^-1培养基中长有单菌落,呈现出大, 黄色,湿润,圆形,隆起,不透明,边缘整齐等特点，而其余培养基均无菌生成；2星期后：5个培养基中,编号 10^-1,10^-2培养基中长有单菌落。 10^-1培养基中长有许多单菌落，其中的单菌落呈现出单个分散,小而均匀,个别微大,颜色有黄色和白色,湿润,部分菌落有隆起,边缘整齐且不透明等特点；10^-2培养基中长有许多单菌落，其中的菌落呈现出单个分散,小而均匀,颜色为粉色,湿润,扁平,半透明, 边缘整齐,有个别边缘不整齐等特点。而其余3个培养基仍没有菌生成.
对染色后细菌镜检观察后，我们发现细菌均呈现出不同特点，细菌种群、数量存在显著差异。
结果观察与讨论:
结果观察:
1. 3天后
5个培养基中,除10^-1 倍稀释度的培养基中长有菌落外,其余培养基均没有菌生成。
10^-1倍稀释度培养基:只生成一个菌落
很小,黄色,湿润,圆形,隆起,不透明,边缘整齐。 2. 1星期后
-1
5个培养基中,除10^倍稀释度的培养基中长有菌落外,其余培养基均没有菌生成。
-1
10^倍稀释度培养基:只生成一个菌落
大, 黄色,湿润,圆形,隆起,不透明,边缘整齐。 3. 2星期后
5个培养基中, 10^-1,10^-2倍稀释度的培养基中长有菌落,其余3个培养基仍没有菌生成。
10^-1倍稀释度培养基:长有很多菌落
单个分散,小而均匀,个别微大,颜色有黄色和白色,湿润,部分菌落有隆起,边缘整齐且不透明。
-2
10^倍培养基:长有很多菌落
单个分散,小而均匀,颜色为粉色,湿润,扁平,半透明, 边缘整齐,有个别边缘不整齐。
菌 辨别要点 落 湿 干 编 厚薄 大小 松 大 表边号 密 小 面 缘 1 2 3 4 5 6 7 8 9 薄 薄 薄 薄 薄 薄 薄 厚 薄 稍大 稍大 小 大 大 稍小 大 很大 稍大 1薄 大 不透 细菌 0 (半湿润) 总结与展望：
1. 蒸汽灭菌后应迅速进行倒平板操作，目的是为了防止培养基凝固。
2. 涂布分离应在培养基完全凝固后进行，不可过早，否则操作时容易将培养基弄破
3. 分装时培养基液不能超过锥形瓶的1/2，目的是为了防止高温蒸汽灭菌时溢出
4. 本次实验最终只有稀释倍数为10^-1的培养基上生长有菌落，分
扁平 扁平 扁平 扁平 扁平 扁平 扁平 隆起 扁平 扁平 整齐 整齐 整齐 整齐 整齐 整齐 整齐 整齐 整齐 整齐 菌落描述 隆颜色 起 正反 面 面 形状 \\ 粉淡色 粉 \\ 粉淡色 粉 \\ 粉淡色 粉 \\ 粉淡色 粉 \\ 粉淡色 粉 \\ 粉淡色 粉 \\ 白黄色 色 圆 黄黄色 色 椭白黄圆 色 色 圆 白黄色 色 辨别 水溶透明结果 性色度 素 半透 细菌 半透 细菌 半透 细菌 半透 细菌 半透 细菌 半透 细菌 半透 细菌 不透 细菌 不透 细菌 析其原因可能有以下几点：
a． 实验操作时，枇杷叶在酒精中浸泡时间太长，大部分菌被杀死
b． 在配置培养基调PH时曾多次调过头，可能对培养基内各离子浓度产生影响，最终导致只有一个菌落
c． 参照其他各组做的植物叶片内生菌的实验结果：几乎都没有菌落；故也可能是植物叶片内生菌较少
5. 每次做实验前都应该有明确的实验方案，了解实验目的，对自己做的实验有清楚的认识
6. 做小组实验时各小组成员应分工明确，团结协作