遗传学实验指导
实验一 染色体组型分析
一、实验目的
1.熟悉染色体的结构特征。
2.初步掌握染色体核型分析的方法。
二.实验原理
染色体核型分析是阐明生物染色体组的构成，从而为物种的起源和进化的研究提供客
观根据，为调查异源染色体的附加、代换乃至易位提供细胞学证明。
植物染色体的核型分析，往往从细胞的形态学特点来分析。它所依靠的形态学指标是：1.染色体长度；2.着丝粒位置；3.副缢痕的有无和位置；4.随体的有无、形状和大小。 三.实验用品：细胞染色体照片，眼科剪刀，测量工具，胶水等。
四.实验方法：
1.剪贴：用眼科剪刀，沿染色体边缘将每一条染色体剪下来，存放备用。
2.配对：首先目测配对，根据染色体长短和形态特征，进行同源染色体配对。 3.排列：
按一定顺序将一个细胞内的染色体进行排队、编号。排列方式有多种，一般从大到小排列，短臂朝上，如玉米、草棉核型；相同长度的染色体，按短臂长度排列，短臂长的在前；有特殊标记的染色体（如随体）可特殊排列，如栽培大麦核型；性染色体单独另排或放在最后。也可将形态相同的染色体归为一组，分成若干组，按组排列，如山羊草属植物染色体核型；异源多倍体要根据不同染色体组排列，如普通小麦核型要按A、B、D三个染色体组排列。 4.测量：
利用测量工具，测量染色体的如下数据： 绝对长度＝照片长度/放大倍数
染色体相对长度＝每对同源染色体绝对长度／染色体总长度 臂比＝染色体长臂／染色体短臂 将上列数字填入表1:
表1 染色体测量数据 序号 相对长度(％) 臂比 类型 5.校正：
根据测量数据校正目测同源染色体配对和染色体排列顺序是否正确，再进行重新排列，并黏贴在实验报告上。
6.分类：依据臂比，将染色体分类。
表2 染色体分类标准 染色体类型 臂比（长臂／短臂） 1.0 正中部着丝点类型（M） 中部着丝点类型（m） 1.01－1.7 近中部着丝点类型（sm） 1.71－3.0 近端着丝点类型（st） 3.01－7.0 7.01-∝ 端着丝点类型（t） ∝ 顶端着丝点类型（T） 第 1 页 共 9 页
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7.核型公式：
根据染色体类型，可以将一种生物的染色体核型书写成一定公式。例如芍药核型为：K(2n)=2X=10=6m+2sm+2st(SAT)。 K代表基本核型，SAT代表具随体染色体，写在括号内，符号前的数字代表该类染色体数目。
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实验二 质粒DNA的制备
一、实验目的
掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。
二、实验原理
在 pH 12.0～12.6 碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体 DNA 变性分开，而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将 pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体 DNA 、大分子量的 RNA 和蛋白质在去污剂 SDS 的作用下形成沉淀，而质粒 DNA 仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体 DNA 、 RNA 及蛋白质，质粒 DNA 尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒 DNA。
三、实验材料、仪器设备及试剂
1. 仪器：低温离心机、冰箱、高压灭菌锅、漩涡振荡器、恒温摇床等 2. 材料： PCAMBIA2300质粒、大肠杆菌DH5α
3. 试剂：LB液体培养基、Amp、SolutionⅠ、SolutionⅡ、SolutionⅢ、TE、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）等
四、实验步骤：
1.菌牙签挑取单菌落，接种于含有 Amp 抗生素的 LB 培养基中， 37 ℃摇床，250 r/min 过夜培养；
2. 吸取1.5 ml 菌液， 5000rpm 离心 2 分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取 1.5 ml 菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净；
3．加入 150μl 溶液 I 振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）；
4．加入 170μl 溶液 II ，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过 5 分钟； 5．加入 170μl 溶液 III 颠倒混匀，放置于冰上 10 分钟，使杂质充分沉淀； 6．12000 rpm 4℃离心7 分钟；
7．吸取上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一 Eppendorf 管中，加入 等体积酚/氯仿/异戊醇，反复混匀，12000rpm离心5分钟。
8.移取上清夜大约500－550μl，加2倍体积乙醇，混匀，离心（12000rpm，5分钟），倒掉酒精。离心数秒，用移液管尽可能除尽酒精。
9.用0.5ml70％的酒精洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉酒精；离心几秒，用移液器尽可能出去酒精，风干。
10．加入25μl的TE（含20μg/mlRNAase）溶液溶解DNA沉淀，既得质粒DNA溶液，-20℃保存备用。
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实验三 DNA琼脂糖凝胶电泳
一、实验目的
掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和基本操作。
二、实验原理
琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的常规方法。通常采用水平电泳，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA分子因其双螺旋骨架两侧带有富含负离子的磷酸根残基，在凝胶缓冲液中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。不同的DNA分子因其所带电荷数、相对分子质量的大小和构象不同，在同一电场中的泳动速度就不一样，从而达到分离的目的。该过程可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。
用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200 bp至近50 kb DNA。长度100 kb或更大的DNA，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。与另一常用的聚丙烯酰胺电泳法相比，琼脂糖电泳在分辨率上要差一些，但在分离范围上广一些，且操作简捷。利用低浓度的荧光嵌入染料——溴化乙锭（EtBr，EB)进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。溴化乙锭是一种荧光染料，它可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发发下，发出红色荧光。如有必要，还可以从凝胶中回收DNA条带，用于各种克隆操作。 影响DNA分子迁移的因素包括： （1）DNA的分子大小和构象
线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。当DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子量有关，还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，超螺旋DNA移动最快，而开环DNA移动最慢。 (2)琼脂糖浓度
一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小，分离小于0.5 kb的DNA片段所需胶浓度是1.2～1.5％，分离大于10kb 的DNA分子所需胶浓度为0.3～0.7％，DNA片段大小介于两者之间则所需胶浓度为0.8～1.0％。
对于琼脂糖浓度的选择遵循以下的关系式：DNA碱基数一定，那么迁移率(μ)的对数与凝胶浓度线性关系，等式表示为：lgμ=lgμ0－k，其中μ0为DNA为自由电泳率，K是回归系数，一般是个常数（可通过标准分子求出)。 (3)电源电压
在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成反比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2 kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 （4）嵌入染料的存在
荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率降低15％。 （5）离子强度影响
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（例如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中，则电导很
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高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。对于天然的双链DNA，常用的几种电泳缓冲液有TAE、TBE、TPE，一般配制成浓缩母液，存储于室温。
三、实验材料、仪器设备及试剂
1．实验材料
质粒DNA 2．仪器设备
超净工作台、恒温水浴锅、移液器及枪头、微波炉、水平电泳槽、电泳仪、紫外检测仪、凝胶成像系统 3．试剂及溶液 (2) 10×TAE电泳缓冲液：1 L含48.4 g Tris，11.4 mL冰乙酸，7.4 g Na2EDTA。 (3) DNA上样缓冲液：50％甘油，0.25％溴酚蓝，4℃储存或－20℃冻存。
(4) 溴化乙锭：配制成10mg/mL母液，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。 (5) 琼脂糖。
四、实验步骤
1. 琼脂糖凝胶的制备
选择与电泳槽配套的合适大小的塑料胶槽，水平放置；配制1×TAE／TBE缓冲液100mL放入三角烧瓶中，称取0.8 g琼脂糖粉放入加热熔化，冷却至60℃左右加入2μL溴化乙锭(终浓度为0.2μg/mL)，充分混匀，倒入模具中(凝胶厚度在3～5 mm)；迅速插上合适大小的梳子，以形成点样孔；待凝胶完全凝固后，小心虫垂直方向拔出梳子，撕去胶带；将凝胶安放到电泳槽内。 2. 点样
核酸样品与上样缓冲液混合后，点样。
指示剂一般与蔗糖和甘油组成上样缓冲液。上样缓冲液的作用有：增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内；使样品呈色，使加样操作更方便，溴酚蓝在碱性液体中呈紫蓝色，二甲苯青的水溶液呈蓝色。 3. 显色
核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色，其次是银染色。用溴化乙锭染色时，根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5μg/mL的溴化乙锭，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15 min。当溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30 min后再观察。溴化乙锭是强致癌物，操作时一定要小心。 4. 电泳后的凝胶照相
将染色后的凝胶置于紫外灯下进行照相。摄影用的紫外波长一般选用302 nm，因为溴化乙锭与DNA复合物在该波长下的荧光产率高，而且此时DNA受到的损伤较小。
五、注意事项
1．配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。 2．琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。
六、思考题
1．琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响? 2．质粒DNA电泳时为什么会出现2~3条带？
实验四 数量性状的遗传分析
一、实验目的
掌握数量性状的统计分析方法
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