荆州市猪瘟、口蹄疫、猪繁殖障碍与
呼吸综合征血清学调查与防控
第1章 文献综述
1.1疫病的发现及其危害
猪瘟又称欧洲经典猪瘟（Hog Cholera，HC或Classical Swine Fever，CSF)，是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV或Hog Cholera Virus，HC）引起猪的一种急性、热性和高度接触传染性传染病，以发病急促、高稽留热、细小血管壁变性引起全身泛发性小点出血、内脏器官（脾）梗塞和坏死、非常强的传染性和非常高致死率等为主要特征[1]。
据报道，猪瘟疫病最早约出现于1810年的美国田纳西州，大约在1833年又在美国俄亥俄州暴发，又有报道，该病于1862年首先出现于英格兰，然后传到欧洲大陆；在我国关于猪瘟的报道，最初可追索到东南大学农科系于1925年研究CSF免疫血清的记载开始，至于何时发现和证明猪瘟存在，没有明确的文字记载[2]。
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)，我国民间俗称为“口疮”、“鹅口疮”、“蹄癀”或“脱蹄症”，是由口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，FMDV）引起猪等偶蹄兽的一种急性、烈性、高度接触性传染病，以口腔黏膜、蹄部、乳房、鼻镜以及皮肤等处病初出现水泡，继而发生溃疡、传播速度极快，发病率极高为主要特征[2]。
据报道，口蹄疫流行历史悠久，最早出现于1514年，H．Fracastorius描述了当时意大利牛群中相继发生的一种疾病，症状类似于现在的口蹄疫，但是直到1898年，德国微生物学家莱夫勒(F．Loeffler)和弗罗施(P．Frosh)才确定，引起牛口蹄疫的病原体是口蹄疫病毒(foot and mouth disease)，从而纠正了之前人们认为FMD的病原是细菌、霉菌或原虫的错误认识，这也是人类认识的第一个滤过性动物病毒[2]。
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，又称为猪蓝耳病（Blue-ear disease），是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍(早产、流产、弱仔、死胎、木乃伊胎等)、幼龄仔猪发生呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病[1,3]。
该病于1987年首次在美国的中西部发现，并分离到病毒株，其后在全美迅速蔓延，并迅速遍及加拿大、德国、法国、荷兰、英国、西班牙、比利时、澳大利亚、日本、菲律宾等国[1,4]。1996年，我国学者郭宝清等首次从国内疑似PRRS爆发流产的猪胎儿中分离出PRRSV，从而证实了本病在我国的存在[1,5]。
猪瘟、口蹄疫和猪繁殖与呼吸综合征是危害养猪业的极其重要的疫病。因此，猪瘟和
口蹄疫被世界动物卫生组织（Office International des Epizooties OIE）列为A类动物传染病和国际重要的检疫对象，且口蹄疫位列之首，在我国列为一类动物疫病；猪繁殖与呼吸综合征列为B类动物传染病，在我国列为二类动物疫病。
据世界粮农组织一世界动物卫生组织一世界卫生组织(FAO．OIE．WHO)出版的《动物卫生年鉴》公布，全世界有44个国家和地区存在猪瘟。美国、阿尔巴尼亚等24个国家与地区宣布消灭了猪瘟。但到1993年后，一些己宣布消灭了猪瘟的国家和地区，如德国、英国、荷兰、瑞士、比利时、瑞典、西斑牙等，又先后出现了猪瘟的复发[6]。1997~1998年，德国、荷
兰、意大利、西班牙、比利时发生接力式的猪瘟流行，造成了数十亿欧元的经济损失，其中特别是荷兰损失最大：爆发猪瘟424起，3个月内扑杀近1 000万头猪，占总养猪量的2/3，经济损失高达20亿美元[7-10]。目前该病主要在亚洲、欧洲、非洲、拉丁美洲的国家与地区流行，尤其在亚洲，猪瘟爆发事件和病例呈逐年上升趋势。近来，宣布自1918年就已消灭了猪瘟的南非也报告爆发了猪瘟[11]。我国是养猪规模最大的国家，也是猪瘟流行比较严重的地区，各省市均有猪瘟流行的报告，每年因猪瘟死亡的病例约占病死猪的l/3以上，给我国造成近100亿元的经济损失[12]。
猪口蹄疫爆发不仅导致动物死亡、病畜及可疑病畜被屠杀焚毁、患病期间肉和奶的生产停止、病后肉和奶产量长期减少、种用价值丧失，还造成对疫区周围的广大范围必须隔离封锁、禁止动物转移和畜产品调运上市、畜产品出口贸易被禁止、对相关产业的影响（如饲料业、畜产品加工业等）、旅游业的影响、环境的污染、成为生物武器的可能。经济的巨大损失，政治上的影响，民众的恐慌。2001年，英国在英国英格兰艾塞斯郡的一家屠宰场，发现了待宰的28头猪患有口蹄疫症状，很快口蹄疫在英国迅速大规模暴发。据统计，英国2001年集中宰杀、焚烧了近700万头感染口蹄疫的牲畜，牲畜及畜产品出口受到抵制、禁运，畜牧业遭受毁灭性打击，造成直接经济损失51亿英镑，间接损失达 200亿英镑（相当于英国国内生产总值的2.5%），虽然2002年元月15日英国宣布已消灭了口蹄疫，但欧盟在2002年9月25日起才解除贸易禁运令[13]。我国台湾1997年爆发口蹄疫，3月10日新竹县的一个牧场首先报告了第1例可疑猪O型口蹄疫病例，截止3月22日，全省共有12个县、市106个猪场，3.7万头猪发病，死亡1.1万头；25日共有357个猪场，9.2万头猪发病，死亡2万头，扑杀1.9万头；26日疫情波及到13 个县市543个猪场，病猪达13.6万头，死亡3.3万头，扑杀病猪2.2万头；29日有14个县市842个养猪场发病，病猪达74万头；至8月底全岛共扑杀病猪和同群猪600万头，此次疫情造成的直接经济损失高达15亿美元，间接经济损失达103亿美元，更为严重的是台湾3年内很难出口生猪和畜产品，每年损失15.5亿美元的外汇收入，相关的饲料业和肉类加工业的损失也达上亿元新台币，给台湾的养殖业造成致命打击[14]。
猪繁殖与呼吸综合征于2006年的6~8月份集中发生于我国高湿高温的南方地区如江西、湖南、湖北、江苏、安徽、浙江等南方省份，疫情传播快，来势猛，波及范围广，各种年龄和各种品种的猪均易感染，临床抗生素治疗效果差或根本无效[71。在一些疫区，发病率、死亡率高达60％以上。由于当时确定不了病因，但所有发病猪均出现高热症状，故称为“高热病”，随后该病毒逐渐扩散和蔓延到相临省份以及我国的大部分养猪地区。截至2007年7月份，我国农业部通报全国已有26个省份发生了高致病性猪繁殖与呼吸综合征，疫点309个，防控形势相当严峻。该疫情在全国范围内广泛流行，导致生猪大批死亡和淘汰，给养猪生产造成了严重损失，引起国内外广泛关注[15,16]。此后，该病一直是严重威胁我国生猪养殖业的重要疫病。
猪瘟、口蹄疫和猪繁殖与呼吸综合征常常混合感染或继发。
1.2病原学
1.2.1猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)
猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)属于黄病毒科(The Family Flaviviridae)瘟病毒属(The Genus Pestivirus)。CSFV是具有囊膜的单股正链RNA病毒，核苷酸约12 kb。病毒粒子的直径为40-50nm，略呈圆形，脂蛋白囊膜有55 kD和46kD两种糖蛋白，上有类似穗样的糖蛋白纤突。病毒粒子有二十面体对称的核衣壳，核衣壳则由36kD的蛋白质组成。病毒分子量约为4x106Da，在蔗糖密度梯度中的浮密度1.15-1.16g/cm3，等电点是pH4.8，沉降系数为140-180S[1,2]。
目前仍认为HCV为单一血清型，尽管分离出了不少变异性毒株，但都属于1个血清型。只有毒力强弱之分，不同毒株之间存在显著差异，强毒株引起死亡率高的急性猪瘟，中等毒株一般产生亚急性或慢性感染，胎儿感染低等毒力株可引起轻微症状或亚临床感染，但胚胎感染或初生仔猪感染则可导致死亡。中等毒力株感染的后果部分取决于猪的年龄、免疫能力和营养状等宿主因素，而强毒株或低毒株感染，宿主因素近4起很小的作用。有的HCV的毒力性状是不够稳定的，通过猪体1代或多代后可使毒力增强[1]。
不同毒株之间抗原存在明显差异，根据对单克隆抗体的反应，可将HCV分为2大抗原群，但未能发现抗原群与毒力之间的关系。
在实验条件下，CSFV很稳定，但温度对培养上清液毒活性有很大影响，病毒粒子在50℃可存活3d，在37℃可存活7d，在－70℃可存活多年(约4年)而不明显丧失其感染性，在冷冻的尸体中至少可存活2个月。病毒在超过60℃且持续60min才能保证完全破坏血清、血液或尿液中的病毒。病毒在PH5.0-10.0时稳定，但在pH3.0时迅速失活，脱纤血中的病毒在pH5.0-5.5时最为稳定。乙醚、氯仿、去氧胆酸盐、诺乃洗涤剂P40和皂角素等可使其迅速失去感染性[]。病毒对胰蛋白酶中度敏感，二甲基亚砜（DMSO）可使病毒稳定，故常将其用于CSFV的冻存液。前列腺素A1能抑制CSFV的增殖，50μg/mL浓度能抑制99%病毒的生成。CSFV的自然宿主是猪和野猪，不能凝集鸡、豚鼠、猪、牛和人的红细胞。CSFV可在猪的骨髓、睾丸、肺、脾和肾的细胞培养物及白细胞中增殖，最常用的是PK-15、SK-6和CPK细胞系，其中最易感的是PK-15、PK-2a和ST等几株猪肾和猪睾丸细胞系[1,2]。
1.2.2口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)
口蹄疫病毒属于小RNA病毒科(Piconlaviridae)，口蹄疫病毒属(AphtllovinlS)。到目前为止，已发现了7个血清型，即O、A、C型(称欧洲型)，SATl、SAT2、SAT3(即南非l、2、3型，称非洲型)和AsiaI(即亚洲I型，称亚洲型)，其中欧洲国家主要有O型、A型、C型，近年
来O1型和A22型发生较多；亚洲国家为O型、A型、C型和AsiaⅠ型，中东地区发生过A22型；非洲国家为O型、A型、C型、SATⅠ型、SATⅡ型、SATⅢ型；拉丁美洲国家为O型、A型、C型。7个血清型可根据核酸同源性大小分为两群，0、A、c和AsiaI为第l群，sATl、sAT2、sAT3为第2群。群内各型同源性达60％～70％，但两群之间同源性仅为25％一40％，血清型间无血清交叉和交叉免疫现象[1]。
口蹄疫病毒粒子为正二十面体结构，直径20～30衄，分子量为6．9X106u。完整的病毒颗粒包括衣壳和RNA两部分，衣壳由vPl、vP2、vP3、vP4各60分子组成，另外还有若干分子的前体蛋白VPO，无囊膜结构。完整的病毒粒子的沉降系数为140s～146s。FMDV的RNA大约由8500个核苷酸组成，5’端无帽结构。
1.2.3猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，
PRRSV)
猪繁殖与呼吸综合征病毒属于动脉炎病毒科(Arteriviridae family)的动脉炎病毒属(Arterivirus)。PRRSV为有囊膜的单股正链RNA病毒，经纯化的病毒粒子在电镜下呈球形，直径为45-83nm，核衣壳直径为25-35nm，呈二十面立体对称，囊膜表面有时可以看到明显的纤突，外包一层脂质双层膜。PRRSV在CsCl和蔗搪密度梯度中的浮密度分别是1.13-1.199
[17]
／cm3和1.18—1.149／cm3。
病毒的基因组RNA具有感染性[18,19]。基因组大小约为15kb，包括8个开放性阅读框(ORFs)，其顺序依次为：5’-ORFIa_ORFIb-ORF(2-7)-3’。位于ORF l上游5’端是非编码区(Non-Coding Region NCR)，核酸序列高度保守。第一个开放性阅读框ORF l位于基因组的5’端，约包含了整个病毒基因组大小的80％。从ORF2到ORF7的所有基因都位于基因组的3’末端。ORF7终止密码子之后为3’非编码区，含有一个poly(A)尾[20]．据报道Lv株3’非编码区为114 nt，比美洲株3’端非编码区少22 nt，两者同源率为59%，利用这种差异可进行PRRSV的分子诊断或毒型鉴定。PRRSV每个阅读框的编码产物都己经鉴定。ORFI编码RNA的复制酶和几个非结构蛋白(Nsps)，ORF2一ORF7的所有基因编码结构蛋白。ORF2到ORF7基因编码的蛋白的分子量大小分别是29—30KDa，45—50KDa，3卜35KDa,25KDa，18-19KDa'15KDa，分别对应的蛋白名称是GP2，GP3，GP4，E(GP5)，M和N蛋白(GP代表糖蛋白)。ORFI编码病毒RNA复制酶其氨基酸序列含有EAV和LDV的保守成分[21]。
蛋白质是PRRSV病毒粒子的主要成分，具有重要的功能。主要阐述一下E蛋白和M蛋白．GP5又称E蛋白，属于糖基化囊膜蛋白，由ORF5编码，分子量为26ku一30ku。GP5蛋白含有2-4个糖基化位点和一段含有31个氨基酸的信号肽，另外还含有一段很大的内部疏水区，可能起锚定膜的作用。GP5有6个抗原决定簇，可诱导产生中和抗体，能在体外中和病毒的感染性，其中和抗原表位既有线性表位，又有构象表位，且GP5的胞外区是最重要的中和表位。通过对GP5中和抗原表位的研究，发现GP5的糖基化与中和活性无关，但其内部构象对中和活性抗体的产生有重要作用。病毒中和作用与抗GP5抗体效价呈显著相关性，而且针对GP5的单抗比GP4的单抗在中和病毒方面更为有效可靠。用含编码GP5的质粒DNA免疫，可使接种猪产生抗GP5的特异性中和抗体。也有研究表明，该蛋白可诱导细胞凋亡。从目前研究看来，GP5蛋白B位点抗原对设计PRRSV疫苗十分有用。M蛋白即膜基质蛋白，由ORF6编码，分子量为18ku一19ku，为非糖基化的膜蛋白。M蛋白在所有的PRRSV株间高度保守，在欧、美型毒株间也最为保守。M蛋白的N端有3个疏水性跨膜区，位于第17-88位氨基酸残基。M蛋白聚集于粗面型内质网上，有一个短肽段暴露于病毒粒子表面，可能与病毒的聚集和结合有关，并与GP5形成异源二聚体。通过感染猪康复血清的Western-bolt证明了M蛋白具有很强的免疫原性，感染后l0 d即可激发产生可检测的抗体应答，故表达的重组M蛋白可以作为血清学试验的靶抗原。尽管康复猪血清中具有针对该蛋白的抗体，但该蛋白并不涉及病毒中和作用。用针对该蛋白的单抗从北美洲分离株和欧洲分离株中识别了2个共同的和1个独特的抗原决定簇[1,21]。
1.3流行病学
1.2.1猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)
该病发生于亚洲大部分国家和地区、中美及南美、非洲及部分欧洲国家。 在自然条件下，猪、野猪是猪瘟病毒唯一的自然宿主，病猪和带毒猪是最主要的传染源，易感猪与病猪的直接接触是病毒传播的主要方式。感染猪在发病前即可从口、鼻及泪腺分泌物、尿和粪中排毒，并延续整个病程。康复猪在出现特异抗体后停止排毒。强毒株感染后10～20 d内排出大量病毒，而低毒株感染后排毒期短。强毒株在猪群中传播快、造成的发病率高。慢性型的感染猪不间断排毒或间歇排毒。
当HCV低毒株感染妊娠母猪时，起初常不被觉察，但病毒可侵袭子宫中的胎儿，造成死产或出生后不久即死去的弱仔，分娩时排出大量HCV。如果这种先天感染的仔猪在出生时正常，并保持健康几个月，它们可作为病毒散布的持续感染来源而很难被辨认出来。因此，这种持续的先天性感染对猪瘟的流行病学具有极重要的意义，Liess用低毒力的野毒Glertoif株给妊娠40日龄、70日龄、90日龄的母猪滴鼻感染，结果引起母猪繁殖障碍。40日龄感染猪发生死胎、木乃伊胎和流产；70日龄感染，所生的仔猪约有45％带毒，出生后出现先天性震颤，多于1周死亡；90日龄感染生后仔猪可存在2-11个月，猪无明显症状，此种感染猪终身带毒、散毒，为HCV的主要贮存宿主，当有这些猪存在时，即可形成猪瘟常发地区或猪场。
猪群引进外表健康的感染猪是猪瘟暴发最常见的原因。病毒可通过猪肉和猪肉制品传播到远方。未经煮沸消毒的含毒残羹是重要的感染媒介。人和其他动物也能机械地传播病毒。HCV可在野猪群中形成循环感染，这在有些国家和地区是对家猪的严重威胁。
在自然条件下HCV的感染途经是口鼻腔，间或也可通过结膜、生殖道黏膜或皮肤擦伤进入。经口和注射感染后，病毒复制的主要部位是扁桃体，然后经淋巴管进入淋巴结，继续增殖，随即到达外周血液，从这时起，病毒在脾、骨髓、内脏淋巴结和小肠的淋巴组织繁殖到高滴度状态，导致高水平的病毒血症。
该病一年四季均可发生，一般以春季、秋季较为严重。急性暴发时，先是几头猪发病，往往突然死亡。继而病猪数量不断增多，多数猪呈急性经过和死亡，3周后逐渐趋向低潮，病猪多呈亚急性或慢性，如无继发感染，少数慢性病猪在1个月左右恢复或死亡，流行终止。 近年来猪瘟流行发生了变化，出现非典型猪瘟、温和型猪瘟，以散发性流行。发病特点临床症状或不明显，死亡率低，病理变化不特征，必须依赖实验室诊断才能确诊。
1.2.2口蹄疫(Foot-and-mouth disease ，FMD)
猪口蹄疫的发生和流行同样离不开传染源、传播媒介、易感猪三者构成的链条，其流行强度、波及范围与病毒株、宿主抵抗力和环境等多种因素有关。
处于口蹄疫潜伏期和发病期的动物，几乎所有的组织、器官以及分泌物、排泄物等都含有FMD病毒。病毒随同动物的乳汁、唾液、尿液、粪便、精液和呼出的空气等一起排放于外部环境，造成严重的污染，形成了该病的传染源。 FMD病毒传播方式分为接触传播和空气传播，接触传播又可分为直接接触和间接接触。目前尚未见到FMD垂直传播的报道。
（1）接触传播 直接接触主要发生在同群动物之间，包括圈舍、牧场、集贸市场、展销会和运输车辆中动物的直接接触，通过发病动物和易感动物直接接触而传播。间接接触主要指媒介物机械性带毒所造成的传播，包括无生命的媒介物和有生命的媒介物。野生动物、鸟类、啮齿类、猫、狗、吸血蝙蝠、昆虫等均可传播此病。通过与病畜接触或者与病毒污染物接触，携带病毒机械地将病毒传给易感动物。
（2）空气传播 FMD病毒的气源传播方式，特别是对远距离传播更具流行病学意义。
感染畜呼出的FMD病毒形成很小的气溶胶粒子后，可以由风传播数十到百千米，具有感染性的病毒能引起下风处易感畜发病。影响空气传播的最大因素是相对湿度（RH）.RH高于55%以上，病毒的存活时间较长；低于55%很快失去活性。在70%的相对湿度和较低气温的情况下，病毒可见于100km以外的地区。
FMD病毒可经吸入、摄入、外伤和人工授精等多种途径侵染易感猪。吸人和摄入是主要的感染途径。近距离非直接接触时，气源性传染（吸入途径）最易发生。此外，不可忽视其他可能的途径，如皮肤创伤、胚胎移植、人工自然授精等。
1.2.3猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)
猪繁殖与呼吸综合征是一种高度接触性传染病，呈地方流行性。PRRSV只感染猪，各种品种、不同年龄和用途的猪均可感染，但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感。患病猪和带毒猪是本病的重要传染源。主要传播途径是接触感染、空气传播和精液传播，也可通过胎盘垂直传播。易感猪可经口、鼻腔、肌肉、腹腔、静脉及子宫内接种等多种途径而感染病毒，猪感染病毒后2～14周均可通过接触将病毒传播给其他易感猪。从病猪的鼻腔、粪便及尿中均可检测到病毒。易感猪与带毒猪直接接触或与污染有PRRSV的运输工具、器械接触均可受到感染。感染猪的流动也是本病的重要传播方式。
持续性感染是PRRS流行病学的重要特征，PRRSV可在感染猪体内存在很长时间。
1.3临床症状与病理变化
1.3.1猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)
猪在胎儿期接触到猪瘟病毒有可能终身感染，潜伏期一般为几个月。仔猪接触病毒后潜伏期为7～10天，通常在感染后5～10天具感染性，但慢性感染病例一般在3个月后才具感染性。
急性型：高热稽留(41～42℃)。食欲减退，偶尔呕吐。嗜睡、挤堆。呼吸困难，咳嗽。结膜发炎，两眼有脓性分泌物。全身皮肤黏膜广泛性充血、出血。皮肤发绀，尤以肢体末端(耳、尾、四肢及口鼻部)最显著。先短暂便秘，排球状带黏液(脓血或假膜碎片)粪块；后腹泻排灰黄色稀粪。大多在感染后5～15天死亡，小猪病死率可达100％。
慢性型：体温时高时低，呈弛张热型。便秘或下痢交替，以下痢为主。皮肤发疹、结痂，耳、尾和肢端等坏死。病程长，可持续1月以上，病死率低，但很难完全恢复。不死的猪，常成为僵猪。多见于流行中后期或猪瘟常发地区。 温和型：多年来一些地区散发一种所谓“无名高热”症，经研究证明多为猪瘟。因其潜伏期长，症状较轻不典型，病死率一般不超过50％，抗菌药物治疗无效，称为“温和型”猪瘟。病猪呈短暂发热(一般为40～41℃，少数达41℃以上)，无明显症状。母猪感染后长期带毒，受胎率低、流产、死产、木乃伊胎或畸形胎；所生仔猪先天感染，死亡或成为僵猪。
病理变化
急性型：白细胞及血小板减少。全身性出血、淤血，尤以(耳根、颈部、胸腹下、四肢内侧)皮肤、淋巴结、喉头、膀胱、肾、回盲处明显。脾不肿大，边缘有暗紫色稍突出表面的出血性 梗死，为猪瘟特征性病变，但一般不常见，仅50％～
70％病例出现梗死病变。常见全身淋巴结肿大、出血，切面周边出血显著，杂有贫血变化，呈红白相间的大理石状，多见于颌下、颈部和腹腔淋巴结。
慢性型：主要为坏死性肠炎，一般在回盲瓣口、盲肠及结肠黏膜上形成同心轮状的纽扣状溃疡，突出于黏膜面，颜色黑褐,中央凹陷。通常无出血及炎性病变。全身性淋巴组织萎缩。仔猪常见胸腺萎缩，肋软骨连接处外生骨疣。
1.3.2口蹄疫(Foot-and-mouth disease ，FMD)
口蹄疫自然感染的潜伏期为24～96 h，人工感染的潜伏期为18～72 h。猪口蹄疫主要症状表现在蹄冠、蹄踵、蹄叉、副蹄和吻突皮肤、口腔腭部、颊部以及舌面粘膜等部位出现大小不等的水疱和溃疡，水疱也会出现于母猪的乳头、乳房等部位。病猪表现精神不振，体温升高，厌食，在出现水疱前可见蹄冠部出现一明显的白圈，蹄温增高，之后蹄壳变形或脱落，跛行明显，病猪卧地不能站立。水疱充满清朗或微浊的浆液性液体，水疱很快破溃，露出边缘整齐的暗红色糜烂面，如无细菌继发感染，经l～2周病损部位结痂愈合。若蹄部严重病损则需3周以上才能痊愈。口蹄疫对成年猪的致死率一般不超过3%。仔猪受感染时，水疱症状不明显，主要表现为胃肠炎和心肌炎，致死率高达80%以上。妊娠母猪感染可发生流产。
病死畜尸体消瘦，除鼻镜、唇内粘膜、齿龈、舌面上发生大小不一的圆形水疱疹和糜烂病灶外，咽喉、气管、支气管和胃粘膜也有烂斑或溃疡，小肠、大肠粘膜可见出血性炎症。仔猪心包膜有弥散性出血点，心肌切面有灰白色或淡黄色斑点或条纹，称虎斑心，心肌松软似煮熟状。
1.3.3猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)
各种年龄的猪发病后大多表现有呼吸困难症状，但具体症状不尽相同。 母猪染病后，初期出现厌食、体温升高、呼吸急促、流鼻涕等类似感冒的症状，少部分（2%）感染猪四肢末端、尾、乳头、阴户和耳尖发绀，并以耳尖发绀最为常见，个别母猪拉稀，后期则出现四肢瘫痪等症状，一般持续1～3周，最后可能因为衰竭而死亡。怀孕前期的母猪流产，怀孕中期的母猪出现死胎、木乃伊胎，或者产下弱胎、畸形胎，哺乳母猪产后无乳，乳猪多被饿死。
公猪感染后表现咳嗽、打喷嚏、精神沉郁、食欲不振、呼吸急促和运动障碍、性欲减弱、精液质量下降、射精量少。
生长肥育猪和断奶仔猪染病后，主要表现为厌食、嗜睡、咳嗽、呼吸困难，有些猪双眼肿胀，出现结膜炎和腹泻，有些断奶仔猪表现下痢、关节炎、耳朵变红、皮肤有斑点。病猪常因继发感染胸膜炎、链球菌病、喘气病而致死。如果不发生继发感染，生长肥育猪可以康复。
哺乳期仔猪染病后，多表现为被毛粗乱、精神不振、呼吸困难、气喘或耳朵发绀，有的有出血倾向，皮下有斑块，出现关节炎、败血症等症状，死亡率高达60%。仔猪断奶前死亡率增加，高峰期一般持续8～12周，而胚胎期感染病毒的，多在出生时即死亡或生后数天死亡，死亡率高达100%。
病变单纯感染，以肺脏为主，肺有出血斑，或有肝变病灶(暗红色)，腹股沟、肺门等淋巴结肿大，出血，胸、腹腔积液，脑积液，如继发感染，则病变复杂化，可出现相应的病
理变化，如心包炎、胸膜炎、腹膜炎及脑膜炎等。
猪繁殖与呼吸综合征病毒感染引起的繁殖障碍所致的死产仔猪和胎儿很少有特征性病变，猪繁殖与呼吸综合征病毒致死的胎儿病变是子宫内无菌性自溶的结果，没有特异性；流产的胎儿血管周围出现以巨噬细胞和淋巴细胞浸润为特征的动脉炎、心肌炎和脑炎。脐带发生出血性扩张和坏死性动脉炎。
生长猪较成年猪更常见特征性组织性病理变化，肺的组织学病变具有普遍性，有诊断意义。单纯的猪繁殖与呼吸综合征病毒感染引起的肺炎以间质性肺炎伴随正常的呼吸道上皮为特征。其特点为肺泡间隔增厚，单核细胞浸润及肺Ⅱ型上皮细胞增生，肺泡腔内有坏死细胞碎片。
猪繁殖与呼吸综合征合并细菌、病毒感染时，病变依合并感染的细菌/病毒的不同而有所变化，合并感染细菌性病原常引起复杂的猪繁殖与呼吸综合征肺炎，间质性肺炎常混合化脓性纤维素性支气管肺炎或被化脓性纤维索性支气管肺炎所掩盖。有些感染病例还可见胸膜炎。鼻甲部黏膜的病变是猪繁殖与呼吸综合征感染后期的特征，其上皮细胞纤毛脱落，上皮内空泡形成和黏膜下层淋巴细胞、巨噬细胞和浆细胞浸润。淋巴结、胸腺和脾脏的组织病理学变化，以发生中心肥大和增生、生发中心坏死、淋巴窦内有多核巨细胞浸润为特征，病早期可见脾脏白髓、胸腺皮质核、扁桃体滤泡淋巴细胞坏死，后期脾核淋巴结细胞增生；另外 猪繁殖与呼吸综合征病毒感染引起的血管、神经系统、生殖系统的病变也主要表现为淋巴、巨噬细胞、浆细胞的增生和浸润。
1.4 疫病流行病学调查方法研究进展
1.4.1猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)
1.4.1.1 琼脂扩散试验(AGPl
可溶性抗原与抗体在半固体琼脂内扩散，在比例适当的情况下，若抗原与抗体能够结合，就会出现白色沉淀线，此为阳性反应。可选用病猪脾、淋巴结做抗原，但以脾脏较好。该法是将琼脂糖按1％浓度加入pH8.6硼酸盐缓冲液或生理盐水中煮沸溶解，倒入平皿中，冷却后置4 ℃保存，临用时打孔，中央打1孔，周围打6孔。各孔据试验目的加人样品，并同时设立对照，置湿盒内于37 ℃孵育，48 h后观察结果。优点：取材方便、经济、操作简单。缺点：特异性和敏感性差，适用于群体抗体检测。 1.4.1.2直接免疫荧光试验(FA)
是最常用的检查猪瘟病毒抗原的方法。Robertson等1965年首次将FA用于猪瘟病料和组织培养物的的检测(Robertson et a1．，1965)。将病死猪脏器，如扁桃体、肾脏、脾脏、淋巴结、肝脏和肺等直接组织触片或制成冰冻切片，亦或者是病毒分离时待检的细胞玻片，将液体吸干后经冷丙酮固定5～10 min，晾干。滴加猪瘟荧光抗体覆盖于切片或细胞片表面，置湿盒中37℃作用30 min。然后用PBS液洗涤，自然干燥。用碳酸缓冲甘油(pH9．0～9．5，0．5 M)封片，置荧光显微镜下观察。必要时设立抑制试验染色片，以鉴定荧光的特异性。 FA检测CSFV抗原，方法简单、快速、技术可靠，同时也可检测批量样品，检测成本相对较低，许多国家将它作为执行猪瘟消灭计划的法定试验。国内中国兽医药品监察所丘惠深研究员、王在时研究员等采用免疫荧光抗体法(FA)净化猪瘟已经在一些猪场取得成功，净化后猪瘟疫情得到了有效控制。 1.4.1.3 正向间接血凝试验(IHA)
正向间接血凝试验是利用CSFV致敏红细胞， 将待检血清梯度稀释后在血凝板上进行抗
原抗体反应，根据红细胞的凝集程度判断结果。此法能够测出猪瘟抗体效价，简便易操作，可用于免疫抗体的监测。近年来，该方法已运用比较普遍，蔡葵蒸等(2002)采用间接血凝试验(IHA)和斑点酶联免疫吸附试验(Dot．EL ISA)检测仔猪血清猪瘟母源抗体，结果表明：IHA比Dot-ELISA能更客观地反映仔猪早期的母源抗体水平，适用于生产中仔猪母源抗体或免疫早期抗体的监测[22]。刘杰标等(2002)对广西宜州市和环江县共790份猪血清进行了猪瘟免疫抗体检测，结果表明两地的猪瘟免疫抗体效价较高，与实际免疫情况基本相符[23]。然而该方法受主观判断影响，并且存在批间差异较大的问题，适用于群体抗体监测。 1.4.1.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)
酶联免疫吸附试验(ELISA)原理是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。该方法具有高度敏感性和特异性，而且它的试剂比较稳定，操作简单且无放射性危害，特别是商品试剂盒和自动化仪器的应用，使其成为一种适用于各级检验部门的免疫标记技术。随着检验医学的不断发展，酶免疫测定的方法、技术也得到发展和更新，Dot-ELISA、发光酶免疫测定、免疫印迹法、BAS。酶联免疫吸附试验等方法不断得到应用。单克隆抗体制备技术的成熟，极大的推动了ELISA技术的发展。对于猪瘟的检测，大量的ELISA方法应运而生。余兴龙(1999)等以CSFV的重组E2基因产物作为包被抗原，建立了检检测CSFV抗体的间接ELISA方法。结果表明该方法具有特异性高、易纯化和成本低等特点[24]。Lin M等研究使用Ems蛋白对3个主导的抗原区作为抗原进行分别研究，结果表明用Erns aal09~160作为抗原的ELISA，优于单纯使用完整Eros片段或Ems片段的部分抗原区的ELISA，并且可将CSF的血清学诊断时间提早到感染后7d。他们后来又进一步研究使用一种嵌合蛋白(C21 EmsE2)作为ELISA的抗原，该蛋白包含CSFV结构蛋白Ems的3个抗原区的公共区，并且包含E2蛋白的抗原激活区。结果表明将嵌合蛋白(C21ErmE2)作为ELISA的抗原，其诊断结果优于单独用Erns和E2蛋白片段作为抗原，重要的是该种ELISA也能检测出感染猪瘟病毒7d后的血清抗体[25,26]。
ELISA方法检测猪瘟抗体已经比较成熟，国内外均形成了成熟的商品化试剂盒，在各专业实验室及基层都得到了很好的运用。在检测猪瘟病原方面，市面上虽然存有商品化的ELISA试剂盒，目前仍然存在敏感性不高，非特异性明显的问题，仅适用于发病猪的检测，在温和性猪瘟与持续性带毒较为普遍的情况下，猪瘟抗原ELISA检测方法还有待进一步提高。
1.4.1.5 反转录聚合酶链反应（reverse transcription PCR，RT-PCR）
聚合酶链反应(PCR)技术的建立带动了分子生物学的飞速发展，应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术成功测定了多株CSFV的全基因序列，为猪瘟的致病机理、免疫机制、检测防控提供了坚实的基础。尤其是CSFVAlfort株和Bresica株基因组全序列的成功测定，使RT-PCR技术在CSFV的研究中被广泛应用。用RT-PCR检测CSFV，其特异性强、灵敏度高、重复性好，整个过程在ld内即可完成，能达到快速检测的目的，并且适合于各种含毒材料的检测，也可用于临床。此外，RT-PCR技术还可区别与CSFV相关的病毒，如BVDV以及能引起和CSF相似临床症状的猪病的病毒，如亚洲CSFV、伪狂犬病病毒，其灵敏度可达100%。这一方法在追踪CSF传播方面被认为比血清学方法更有效、更优越。迄今为止，各国学者利用RTPCR反应扩增并测定CSFV基因eDNA片段序列，用生物软件分析毒株间的遗传进化关系追踪CSFV传播来源和对猪瘟进行诊断，对猪瘟的防控和扑灭将起到不可替 代的作用。贾建军(2002)等从经临床和血清学初步诊断为CSF的病料中扩增了CSFVE2基因片段，为CSF的诊断和检疫提供了一种特异可靠的方法[27]。陆芹章等(2004)应用RT-PCR方法检测了广西19个养猪场的58份疑似猪瘟病料，结果显示，阳性数为34份，阳性率为58．62％[28]。罗廷荣等(2005)应用RT-PCR对来自广西不同地区的135份疑似CSF病料进行
检测，阳性数为84份，阳性率62.2%[29]。大量的研究表明，应用RT-PCR进行猪瘟的诊断已经成熟。
1.4.1.6 Real-Time RT-PCR
目前Real-Time RT-PCR方法以其快速、灵敏、低污染率的优点跻身于各种检测方法中，在猪瘟的早期检测及预防、控制上起到重要作用。温国元(2004)等采用荧光定量PCR技术对CSFV进行快速定量检测，结果表明：该方法的检测灵敏度可达10copy/μL。将该方法与RT-PCR、RT-nPCR进行比较，发现该方法检测灵敏度比RT-PCR高100倍，与nPCR具有相同的灵敏度，该方法的最大优点是避免了常规PCR电泳检测所带来的高污染率[30]。Ophuis等(2006)用Real-Time RT-PCR方法检测猪瘟病毒感染猪体后病毒的动态分布，结果在攻毒后的第1d于扁桃体检测到病毒，在第3天d时于下颌淋巴结、脾脏、回肠和肠系膜淋巴结检测到猪瘟病毒[31]，为预防和控制该病作出早期诊断有较大意义。
1.4.2口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)
1.4.2.1 琼脂扩散试验（gel diffusion test，GDT）
该方法既可以检测病毒抗原，也可以检测抗体．在琼脂中FMDV抗原和标准阳性血清或未知的被检血清之间形成免疫沉淀线，并能在48h之内提供结果。长期以来，该试验主要用于血清样品中FMDV的检测。
1.4.2.2 补体结合试验（complement fixation test，CFT）
1952年Broksby建立了补体结合试验（CFT），近年来，CFT常用于FMD病料的检测和分型[]。CFT既可鉴定抗原，又可鉴定抗体，并可定量。但CFT方法相对不够敏感，且有易解释样品的亲补体活性和抗补体活性。
1.4.2.3 病毒中和试验(virus neutralization test ，VNT)
病毒中和试验是利用血清中和抗体与病毒特异性的结合作用，使病毒失去吸附细胞的能力或抑制其侵入和脱衣壳，丧失对易感动物和敏感细胞的感染力。VNT既可鉴定抗原，又可对抗体定量测定，具有型特异性，是经典的FMD检测方法，常作其它方法的参照。该方法用于FMD感染急性期和恢复期的血清(发病后2~3周)检测，可根据病毒一血清混合物的动物发病死亡数或产生CPE的细胞孔数来判定血清中所含抗体量和血清亚型。多年以来，一直被作为血清学监测的传统方法[32]。VNT虽然具有型特异性但它需要细胞培养，需要2~3 d才能够获得结果。被检血清低效价导致的假阳性有时出现。动物精神沉郁或偶然发病、发烧也会干扰VNT结果[33]。VNT又需要单层培养细胞，因此细胞生长状态，病毒的细胞嗜性，细胞的污染，以及血清样品因素均对VNT的推广和应用带来诸多限制性因素。
1.4.2.4酶联免疫吸附试验(ELISA)
ELISA至1989年被欧洲FMD防制委员会推荐广泛使用，成为国际认可的一种标准化诊断技术。近年来，ELISA已先后用于FMD病原和血清样品的诊断并逐步代替补体结合试验以及中和试验。这项技术快速、敏感、准确，检测田间样品时ELISA的敏感性高于补体结合试验；对于病毒含量较高的样品，例如新鲜的水疱皮和细胞培养物，可在2~4 h内获得结果，应用预先在实验室内包被的免疫反应板以及冻干剂，将更便于现场检测。2004年Paiba GA等应用固相竞争ELISA(SPCE)对绵羊、山羊和猪分别进行了O型FMD血清学抗体检测，并对效果进行了比较。试验对2001年英国爆发FMD其问的267头绵羊和143头猪分别进行VNT和SPCE检测，发现SPCE较VNT能够检测出更多的阳性结果。2001年英国FMD
爆发期间大规模的血清学调查已充分证实了SPCE方法的灵敏性、可施行性和可重复性。同时田问血清学实验和实验室血清学实验也同样表明与VNT相比，SPCE方法的敏感性很少因病毒毒株的不同而受影响[32]。以ELISA为基础的检测方法，有许多客观的优越性，．敏感性相对较高且适合于大规模的血清学调查，FMDV非结构蛋白特异性抗体会存在于FMDV持续感染、短期感染、间歇性感染的猪体，因此FMDV非结构蛋抗体检测试剂盒已经被研制．台湾省已经开始使用NSP抗体检测ELISA试剂盒。ELISA同时也存在着弊端， Fan 等（2004）对3种FMDV非结构蛋抗体检测试剂盒检测效果进行了对比研究。这些FMDV非结构蛋白抗体检测试剂盒被分别应用于健康猪、感染猪和疫苗免疫过猪，并对试剂盒的特异性与灵敏度进行了检测。表明特定的三种FMDV非结构蛋白抗体检测试剂盒都很难将感染病畜与已康复牲畜区分开，这给检测工作带来了较大的困难[34]。
1.4.2.5聚合酶链反应（PCR）
PCR方法已经成为FMDV检测方法中的一种。近年来随着PCR技术的不断成熟。该技术在检测FMDV方面也有了较大的进展。这种方法不但可以检测活病毒核酸，也可直接检测灭活的核酸片段。RT-PCR和DNA序列分析相结合进行病毒核酸序列分析是最具权威性的分析毒株异同的方法。应用PCR诊断FMDV。以持殊设计的引物作介导及在反转录酶的作用下再进行PCR扩增，扩增产物用PAGE或琼脂糖电泳或硝酸银染色检查，看扩增出的DNA片段大小与设计是否相符。用此技术诊断FMD的报道始见于1991年，Meyer等【3q根据编码FMDV RNA的多聚酶基因序列(此段为FMDV7个血清型的高度保守区)设计合成一对引物和探针，经RT-PCR扩增，获得454bp扩增产物，用寡核苷酸探针杂交显示强阳性反应，NcoI酶切证实了预计限制性位点。Laor等（1992）在变化的VPl基因序列中选择引物，则可用于鉴别FMDV以色列株．选择使用不同的引物，可以达到诊断和定型FMDV的目的[35]。 迄今已有美国、英国、西班牙等国家和地区报道了PCR在FMD诊断中的研究及应用，国内早期吴时友等（1991）就FMDV的PCR检测研究作了报道[36]。朱彩珠等（1998）也将此项技术应用于FMD的诊断，可检测出20倍TCID50（细胞毒）或0.16~0.32LD50(组织毒)的病毒量[37]。该法特异性好，检测灵敏度高，可以检测病毒也能直接检测核酸片段，样品可以是水疱液也可以直接用扁桃体、淋巴结、肌肉和蹄、皮肤等组织，这是免疫学方法无法替代的，此方法需要较高的实验设备和熟练的分子生物学实验操作技能，到目前为止，尚未在检疫中推广应用，仅限于专业实验室应用。选择一对适合于FMDV所有血清型及亚型的引物对是最首要的问题，所设计的引物需能够将与FMD临床症状相似的小核糖核酸病毒区分开来。引物序列需在基因的高度保守区进行选择，例如：没有结构蛋白RNA聚合酶和5’不翻译区域。当设计分型引物时，通用型引物需设计在VP1 3’末端的高度保守区。设计出的引物能够成功的将七种血清型的此区域扩增出来。VPl结构蛋白主要反应了FMDV不同血清型的变化，同时对于不同的FMD分离株，可以进行VP1基因编码区的序列分析，建立系统生发树。
1.4.3猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)
1.4.2.1 酶联免疫吸附实验(ELISA)
本法主要用于检测PRRSV抗体。ELISA与IMPA比较，检出PRRSV抗体的时间要迟2d，但可同时检出欧洲型和美洲型PRRSV抗体，并且简单、快速。我国研制的ELISA诊断试剂盒检出的阳性率普遍偏高，其特异性有待探讨。
1.4.2.2 免疫胶体金技术（Immune colloidal gold technique，ICGT）
李军等（2001）建立的胶体金技术检测PRRSV最低检测浓度为2.14μg／mL，即4.28 ng
／点。本法主要用于检测感染组织中的PRRSV抗原。用这种方法可直接检测冰冻切片、酒精或福尔马林固定的组织中的PRRSV，主要检测肺组织，也可用于检测感染PRRSV的PAM。标记胶体金的单克隆抗体和病毒结合，在电镜下可明显看到病毒的形态[38]。 1.4.2.3 乳胶凝集试验（Latex Agglutination Test，LAT）
王忠等(2002)Ⅲ1利用纯化的PRRS重组M蛋白致敏乳胶制成乳胶抗原，成功地将LAT 用于PRRS血清抗体的检测，LAT具有良好的特异性。用LAT与国外IDEXX公司的PRRSV抗体检测试剂盒同时对76份猪血清样本进行检测，结果表明LAT的特异性和敏感性均为95．4％，与国外IDEXX公司PRRSV抗体检测试剂盒的总符合率为87％，检出率基本一致[39]
。因LAT具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强、价格低廉可用于现场检测等优点，故其是一种适合基层兽医单位检测PRRSV血清抗体的新方法。
1.4.2.4 HA和HI试验（Hemagglutination，HA；Hemagglutination Inhibition，HI）
PRRSV不凝集多种动物的红细胞，但可凝集BALB/c鼠红细胞，病毒材料经过吐温80和乙醚处理后血凝活性增强，效价增加4~8倍，效价可达1：128。用Marc--145细胞培养的PRRSV，经过吐温80和乙醚处理后，4℃和37℃均可凝集小鼠红细胞，并且这种凝集被PRRSV特异性抗体所抑制。此法简单，但能否直接检测组织中的PRRSV还需探讨。本方法由于处理病毒尚存在一些未解决的问题，所以在我国还未广泛使用。 1.4.2.5 反转录聚合酶链式反应技术(RT-F'13R)
建立RT-PCR检测方法的原则是扩增病毒特异而保守的基因片断，PRRSV主要是扩增最为保守的ORF7(编码N蛋白)。RT-PCR提供了一种良好的可替代细胞培养检测PRRSV的方法。K Hoelle等(1998)建立了一步法检测PRRSV的RT-PCR技术，其敏感性及特异性均较好，检测结果表明一步法可以从病猪血清中检测出病毒，最早于感染后24h检测出病毒，与病毒分离及血清学技术相比，RT-PCR技术方便快速准确[40]。EgliC等 (2001)报道了用定量Taqman RT-PCR方法检测PRRSV，通过与其它检测方法比较，发现在省时、易用性、敏感性及特异性上都具有一定的优越性，而且不仅能够减少交叉污染的风险，还能区分不同的毒株[41]。
娄高明等 (2000)根据ORF7设计了一套引物，建立了检测PRRSV核酸的RT-PCR方法，通过对标准毒株的检测，证明该方法不仅能够扩增出特异性的核酸片断，同时可从基因水平上区分PRRSV的美洲型和欧洲型[42]。赵耘等(2003)依据ORF7设计了3条引物，以此建立了套式RT-PCR检测方法，并分别对VR--2332株、Lv株及B13株进行套式RT--PCR扩增，结果从3个不同地区分离的毒株中均能特异性地扩增出相应片断，大小分别为430bp、410bp及410bp。而3个生殖疾病相关病毒(猪瘟病毒、细小病毒、伪狂犬病毒)均未扩增出相应的片断，比一步法RT-PCR方法的敏感性提高了一万倍，该法的建立使PRSV的检测更为敏感、快捷及准确[43]。
1.5 疫病防控研究进展
1.5.1猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)
1.5.1.1 弱毒疫苗
中国猪瘟兔化弱毒疫苗(Hog cholera lapinized virus，HCLV)是世界上公认的最为安全有效的疫苗，它是1955年中国兽药监察所周泰冲等将猪瘟强毒强行适应家兔后选育的一株对猪基本无毒力，却仍保持CSFV免疫原性的兔化弱毒株。由于该疫苗免疫力强，保护猪效果好且持久，可抵抗所有CSFV强毒株的攻击，而且有遗传性质稳定，无残余毒力等优点，所以被认为是最好的CSFV弱毒疫苗，从1956年起，在我国广泛应用，为在我国控制和消灭
猪瘟，做出了巨大贡献，该疫苗在国外应用，也取得了良好效果[1]。
日本的CSFV GPE株细胞弱毒来源于CSFV野毒ADL株，是鼠肾细胞传代142代，牛睾丸细胞传代26代减毒，再适应于豚鼠肾细胞传41代，得到一株30℃低温条件繁殖的细胞培养弱毒苗，在日本的猪瘟控制中发挥了重要作用。
法国的Thiverval株弱毒疫苗是从CSFV Alfort毒株中分离到的冷变异株。将Alfort毒在仔猪原代细胞中传代后转入牛肌肉细胞，29℃~30℃培养传代170代使得变异株具有“冷”和“脆弱”遗传特性。保持了较好的免疫原性，不返强，能h很z好地保护猪，是较为有效的一株CSFV弱毒疫苗。
传统疫苗具有免疫原性优良，免疫谱广、安全高效、遗传稳定性良好等优点。但是由于弱毒疫苗干扰猪瘟血清学诊断，使人们难以区别猪瘟感染猪和免疫猪；弱毒活苗还有可能与野毒重组或进行自然突变而造成毒力返强，并可通过母猪胎盘感染造成胎猪死亡、弱仔、先天性感染仔猪，导致出现免疫耐受现象。欧盟己禁止使用猪瘟弱毒疫苗，而采用扑杀感染猪来控制和消灭猪瘟，采用扑杀政策需要大量的人力、物力和巨额资金投入，发展中国家是难以承受的，因此开发猪瘟的新型疫苗显得尤为迫切。近年来随着基因工程技术的迅速发展为猪瘟新型疫苗的研究和开发提供了新的工具。
1.5.1.2 基因疫苗
为了寻求更有效的抗猪瘟疫苗，专家们主要研制CSFV E2基因制备基因疫苗。余兴龙等（2000）应用CSFV石门J株主要保护性抗原E2基囚的真核表达载体接种动物，可刺激小鼠产生抗CSFV的较强的免疫应答反应，使猪能够抵抗石门强毒的攻击[44]。Hammond等（2001）用表达CSFV E2基因的裸露质粒DNA免疫断奶仔猪(6周龄)和17日龄提前断奶仔猪，然后用表达E2基冈的腺病毒重组体(rPAVgp55)对这2组猪群均加强免疫1次，再用CSFV攻毒。研究表明，试验条件下应川基斟疫苗初免后蒋用重组疫苗加强免疫这一联合免疫程序可减少或阻止CSFV攻毒后猪体的排毒[45]。Andrew 等（2000）应用编码gp55的基因疫苗免疫猪只，同样能使猪只获得对CSFV的较好的抵抗力[46]。 1.5.1.3 2亚单位疫苗
目前比较成功的是杆状病毒表达的E2蛋白亚单位疫苗。去掉了跨膜区，表达的重组蛋白高水平地分泌到昆虫细胞培养液中，E2蛋白的含量是影响疫苗效力的决定性因素。Uttenthal等（2001）证明，E2亚单位疫苗单免后第14 d，接种猪通常可以完全抵抗经口和鼻腔途径接种的强毒攻击[47]。Hulst 等(1993)将猪瘟病毒E2基因cDNA重组入核型多角体病毒(ACNPV)，并在sf21细胞中表达。用20~100g的表达蛋白免疫猪，可抵抗100LD50的猪瘟强毒攻击，其诱导产生的中和抗体水平远高于由弱毒疫苗免疫产生的水平[48]。目前，该蛋白的表达水平已被提高至609/mL，并且该疫苗于1998年被列入欧洲药典。Dong等(2005)研究表明，E2蛋白的A亚区为E2蛋白主要的保守区域，由A亚区制备的多肽疫苗可完全抵抗强毒的攻击。到目前为止，许多研究者对E2基因亚单位疫苗进行了效力试验，证明其对猪有良好的保护作用，但是不能有效防止猪瘟病毒的传播[49]。 1.5.1.4 口服疫苗
在欧洲，为消除野猪传播CSFV的危险，人们提出用口服苗对野猪进行免疫，Volker等(2001)人利用c株制备猪瘟口服疫苗，经本动物试验表明，所有试验猪在免疫10 d后，均可获得保护，免疫保护长达6～10个月[50]。Patricia等(2007)利用BVDV CP7基因与猪瘟弱毒株E2基囚联合制备口服疫苗，结果表明，所有试验猪在免疫21 d后，均可获得保护[51]。
1.5.2口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)
1.5.2.1 弱毒疫苗
FMD 弱毒疫苗是把原始毒通过豚鼠(乳鼠)、鸡胚、细胞连续传代驯化或人工诱变的途径获得人为的减毒(致弱) 毒株, 经接种制苗材料, 大量扩增病毒后感染组织培养物, 加入一定的保护剂和佐剂制成的病毒制剂。国外研究表明FMDV 毒力可以被致弱。而我国在20世纪80年代培育出温度敏感毒株, 并培育了O型OP4细胞培养弱毒疫苗。但病毒对一种动物的减毒并不能保证对其他动物减毒, 且由于新的亚型不断出现及毒株致弱结果和致弱时间都不能确定。1964年欧洲口蹄疫防治委员会决定欧洲国家不用弱毒疫苗免疫, 停止了弱毒疫苗的研究[2]。目前世界许多国家和地区在FMD的防制中都采用灭活疫苗。
1.5.2.2 灭活疫苗 常规灭活疫苗是经一系列试验动物选择的田间毒株经病毒培养系统大量扩增获得的病毒制备物, 灭活剂处理后添加佐剂制成的一类生物制品。1925年Belin 首次用甲醛灭活牛舌皮组织病料制成了灭活疫苗；1966年Lapst ich和Te lling 等应用乳仓鼠肾传代细胞( BHK-21) 深层悬浮培养法制备口蹄疫疫苗, 可大量培养细胞、增殖病毒和制造疫苗。意大利在60年代早期研制成功牛原代肾细胞转瓶培养法生产口蹄疫抗原, 以及后来投产的BHK-21克隆13 转瓶单层培养法, 也存在劳动强度大及易散毒的缺点。现在大多数口蹄疫灭活疫苗仍用BHK-21克隆13或IBRS-2细胞生产。
目前广泛应用二乙烯亚胺( BE I) 作为灭活剂。佐剂有氢氧化铝胶、皂素、弗氏不完全佐剂、油包水乳剂等。灭活疫苗的缺点是热稳定性差,需要低温保存, 免疫持续期短, 抗病毒谱有限, 不能区分注射疫苗动物和自然感染动物, 同时存在病毒灭活不彻底而散毒的可能性。
1.5.2.3 基因工程疫苗
基因工程疫苗由于只含有病毒衣壳蛋白，不含有核酸，因而具有很高的安全性。FMDV 抗原结构研究表明，VP1 片段是FMDV 的主要抗原位点，能诱导机体产生保护性的中和抗体，并能产生部分的保护作用。因此，分离纯化完全的VP1片段或其C 端1/2部分就成为人们制备FMDV 基因工程疫苗的目标。1981年Kleid等成功地进行了FMDV基因在原核细胞中的表达，免疫牛和猪后能产生中和抗体[52]。1995年McKenna等通过基因工程技术构建了一株缺失RGD 的FDNV, 并用此病毒接种牛使之产生抵抗强毒株攻击的免疫力[53]。Song 等将O型FMDV VP1蛋白与CTB一起进行表达后接种小鼠, 发现该融合蛋白能诱导小鼠产生中和抗体, 且通过腹腔和鼻内接种小鼠比口腔接种有更高的保护率。用该蛋白免疫接种猪时, 经3次接种后有免疫反应产生, 并且攻毒时80% 的猪被保护[54]。杨光等以FMDVVP1的B 细胞表位和T细胞表位串联的方式构建牛O型口蹄疫病毒VP1 表位疫苗, 试验结果表明, 以此方式构建的重组蛋白能够诱导豚鼠产生具有保护性的抗牛O 型FMDV 中和抗体, 可有效的诱导机体的免疫应答, 以促进中和抗体的产生[55]。 1.5.2.4 合成肽疫苗
所谓合成肽疫苗是用化学合成法人工合成病原微生物的保护性多肽, 并将其连接到大分子载体上, 添加佐剂制成的疫苗。它是一种仅含免疫决定簇组成的小肽。Kupriianova等应用44~63个氨基酸, 即FMDV-A22 株VP1 基因第135~159、170~190和197~213位氨基酸所构建的合成肽疫苗, 通过免疫豚鼠和小鼠, 证明了相对于含有较少氨基酸的合成肽来说, 其免疫效果有显著的提高[57]。通过不断的试验发现, 不同的载体蛋白与FMDV 的免疫原性肽段偶联后可增强其免疫原性。FMDV抗原结构的研究为合成肽疫苗的研制提供了理论依据, 但这些抗原位点不仅不是病毒粒子上惟一的中和性位点, 也不一定能被所有的宿主动物识别, 而且合成肽由于其分子较小, 空间构象简单, 因而对免疫系统的刺激强度和识别信号不够, 不仅难以产生针对高度变异的小RNA 病毒的保护作用, 相反还有利于抗原变异株的选择性适应。这导致这些疫苗在大规模使用时候, 效果并不理想。有效合成肽疫苗的研制还需对FMDV 的免疫机理作深入的研究。
1.5.3猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)
1.5.3.1 灭活苗与减毒苗
加拿大Rogan等的研究表明，用PRRS灭活疫苗免疫猪后，可以刺激猪产生针对ORF5、ORF6、ORF7所编码的蛋白的抗体，而且可减少猪病毒血症的发生。剖检结果表明，接种灭活疫苗后，可有效地阻止肺部病变。因此，他认为PRRS灭活苗能为猪提供安全、有效的保护[57]．美国Gorcyca等研制出一种减毒疫苗，用于3～18周龄猪和后备母猪的免疫。在接种后7 d可产生保护性免疫，免疫期可达16周。与幼龄仔猪相比，育成猪接种疫苗后的病毒血症水平较低，时间较短，肺部病变较少且生长较好。田间试验证明，这种疫苗对PRRS流行区的保育猪和哺乳仔猪有明显的保护作用[58]。Boehringer Ingleheim公司于1995年首次推出商业化减毒疫苗Resp PRRSVTM，已获准用于3～18周龄猪的预防接种。弱毒苗可能繁殖性能造成不利影响，甚至可通过子宫感染胎猪。另外，弱毒苗的便用还可能造成苗毒的传播，引起PRRS的持续感染和病毒血症的发生。
1.5.3.2 基因工程疫苗+
近年来在PRRSV分子生物学方面的研究表明PRRSV的GP5和GP3蛋白均是主要保护性抗原，利用杆状病毒表达的GP5和GP3蛋白制成亚单位疫苗在动物体内可诱导较好的保护性免疫。因此，利用一种可以高效表达的酵母系统(hiapastoris)在体外高效表达PRRSV的GP5和GP3，并制成亚单位疫苗将具有十分广阔的应用前景。氧化酶基因启动子是一种强启动子，能控制异源基因在其中高效表达，表达水平高达35％。Plana用杆状病毒表达的GP3免疫猪，甚至可产生比GP5蛋白免疫具有更好的保护作用，并发现通过重组的GP3-GP5蛋白共同免疫可产生更好的免疫效果。陈建君（2005）用大肠杆菌表达的GST--GP5融合蛋白免疫猪后，不仅能检测出针对GP5的中和性抗体，而且可产生针对GP5的特异细胞免疫。另外，还可有效地阻止肺泡巨噬细胞的损伤，因此，GP3--GP5有望成为亚单位疫苗的候选者[59]。田志军等（2005）将编码GP5、GP4、M、N的基因ORF4、ORF5、ORF6和oRF7克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3．1(+)上，免疫猪可激发较强的体液免疫和细胞免疫，通过淋巴细胞增生试验和检测干扰素IFN-γ发现，PRRSV的4种结构蛋白均是主要免疫原，可使71％免疫猪产生体液免疫反应，其中GP5、6P4诱生的抗体具有中和作用；86％免疫猪产生细胞免疫反应[60]。国内外在基因免疫上已取得的研究结果表明，PRRS核酸疫苗的研制与开发不但可能。而且具有重要的应用价值和广阔的市场前景。随着PRRSV感染性克隆的成功构建，通过基因的缺失或替换基因组的某些部分等基因工程技术而研制出安全、高效的基因工程疫苗已成为可能。
第2章 试验部分
2.1 试验材料与方法
2.1.1 待检血样
采至荆州市荆州区、沙市区、石首市、洪湖市、松滋市、监利县、江陵县、公安县、市开发区等9县/区16个猪养殖场，分别在4月和11月采血，共958头份。
2.1.2 检测试剂
猪繁殖与呼吸综合征IgG抗体检测试剂盒（酶联免疫吸附试验，包括包被抗原的微
孔板、酶标记抗猪IgG抗体、标准阳性对照血清、临界阳性对照血清、标准阴性对照血清、显色液A、显色液B、终止液、10×浓缩洗涤液、样品稀释液），批号20110408，由康百得(深圳)猪繁殖与呼吸综合征生产。猪瘟正向间接血凝（IHA）抗体检测试剂盒（批号20110312）、猪口蹄疫正向间接血凝（IHA）抗体检测试剂盒（批号20110410）
2.1.3 试验仪器
318MC型酶标定量测定仪由上海三科仪器有限公司生产。恒温箱、低温冰箱、微量移液器等均由荆州市动物疾病预防控制中心和长江大学动物科学学院实验室提供。
2.1.4 血样采集与血清分离
通过前腔静脉或耳静脉采血。对采血部位消毒后，用一次性灭菌注射器采血2 mL ~3 mL，室温放置待血清自然析出，或37℃放置1 h后置4℃过夜，分离分装血清，在-20℃贮存备用。待所有血样采毕后取出融化，进行ELISA检测。
2.1.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）操作
使用方法及操作步骤参考试剂盒说明书。
样本稀释：用样本稀释液将待检血清按1：40稀释，阴阳对照不用稀释，直接加样。
加样反应：取出反应板条，样本检测孔每孔分别加已稀释样本血清100μL；同时设阴性、阳性及空白对照各1孔，取阴性、阳性对照各100μL分别加入反应孔内，空白对照孔仅加入100μL样本稀释液。37℃避光反应30 min后甩去孔内液体，每孔加洗涤液1滴，立即用蒸馏水注满，静置30 sec后甩去，再用蒸馏水洗涤4次，每次均静置30秒后甩去，最后一次甩去拍干。
加酶反应：除空白对照孔外，其余每孔加酶结合物2滴，37℃避光反应30分钟后甩 去孔内液体，如上洗涤，拍干。
显色反应：加底物和显色剂各1滴，混匀，37，℃避光显色10分钟。加中止液1滴，混匀，中止反应。
结果判断： 以空白对照调零用酶标仪于450 nm读取OD值，待检孔OD值大于阴性对照。2. 1倍为阳性。按不同地区、不同日龄分别对免疫猪场和未免疫猪场血清阳性率进行统计。
2.1.6 正向间接血凝试验
稀释液：在血凝板上1~6排的1~9孔、第7排的1~4孔、6孔；第8排的1~12孔各加稀释液50μL。
稀释待检血清：取1号待检血清50μL加入第1排第l孔，并将塑料滴头插入孔底，右手姆指轻压弹簧1-2次混匀(避免产生过多的气泡)，从该孔取出50ul移入第2孔，混匀后取出50μL移入第3孔，直至第9 孔混匀后取出50μL丢弃，此时第1排1-9孔待检血清的稀释倍数依次为：1：2、l：4、l：8、1：16、l：32、l：64、1：128、l：256、l：512。
取2号待检血清50μL加入第2排；取3号待检血清加入第3排??均按上法稀释，每取一份血清必须更换取液塑料滴头一个。
稀释阴性对照血清：在血凝板上的第7排第l孔加入阴性血清50μL，对倍稀释至第4孔，混匀后从该孔取出50μL丢弃。此时阴性血清的稀释倍数依次为1：2、1：4、1：8、l：16。第6孔为稀释液对照。
稀释阳性对照血清：在血凝板上的第8排第1孔加入阳性血清50μL，对倍稀释至7第12孔，混匀后从该孔取出50μL丢弃。此时阳性血清稀释倍数依次为l：2~1：4096。
加猪瘟正向血凝诊断液(血凝抗原)：在待检血清各孔、阴性对照各孔、阳性对照各孔、稀释液对照孔，分别加入猪瘟血凝抗原25μL。
振荡混匀用手轻轻振荡摇匀，然后将血凝板放在白色的实验台上观察各孔红血球是否混匀，不出现血球沉淀为合格。盖上玻板，室温下或37\下静置1.5-2 h判定结果。
判定标准：以50％红细胞出现凝集的最大稀释倍数为该血清的血凝效价。血凝抗原滴度不低于l：256为合格。抗体大于或等于1：16为免疫合格，小于l：16视为不合格。
2.1.6 数据统计分析
采用软件SPSS12.1进行数据统计分析。
2.2 结果与分析
2.2.1检测结果
958头份猪血清样品，以正向间接血凝试验分别检测口蹄疫病毒和猪瘟病毒特异性抗体，以ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体，结果见表2-1、表2-2、表2-3。
从表2-1中可见，猪口蹄疫免疫的平均合格率为67.7%，未达到70%的规定标准；免疫合格率达到70%的猪场有9个，达标率为56.3%（9/16）；免疫合格率高的场有2个为100% ，低至0% 1个。
从表2-2中可见，猪瘟免疫的平均合格率为72.8%，达到70%的规定标准；免疫合格率达到70%的猪场有9个，达标率为56.3%（9/16）；免疫合格率高的场有1个为100% ，低的为30.6%。
从表2-3中可见，猪繁殖与呼吸综合征免疫的平均合格率为56.8%，未达到70%的规定标准；免疫合格率达到70%的猪场有7个，达标率为48.6%（7/16）；免疫合格率最高的场有为100% ，低的为22.5%。
从表2-4中可见，口蹄疫、猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征3项免疫率合格的场：6个，占37.5%；2项免疫率合格的场：3个，占18.75%；1项免疫率合格的场：1个，占6.25%；0项免疫率合格的场：6个，占37.5%。
表2-1 猪口蹄疫血清抗体检测结果
场 样本数 合格数
1 108 90
2 40 40
3 94 81
4 48 37
5 50 21
6 40 25
7 40 0
8 103 12
9 48 23
表2-2 猪瘟血清抗体检测结果
场 样本数 合格数
1 108 92
2 40 36 90.0
3 94 83 88.3
4 48 39 81.3
5 50 37 74.0
6 40 18 45.0
7 40 17 43.6
8 103 45 44.1
9 48 30 62.5
合格率% 85.2
场 样本数 合格数
10 40 37
11 28 15
12 49 49
13 60 39
14 110 98 89.7
15 48 47 97.9
16 52 15
总计 958 697
合格率% 94.1 53.6 100.0 65.0 30.6 72.8
表2-3 猪繁殖与呼吸综合症血清抗体检测结果
场 样本数 合格数
1 108 77
2 40 29 72.5
3 94 58 61.7
4 48 31 64.6
5 50 20 40.0
6 40 17 42.5
7 40 9 22.5
8 103 32 31.1
9 48 16 33.3
合格率% 71.3
表2-4 免疫合格率分布
场 FMD CSF PRRS
10 + + +
11 — — —
12 + + +
场 FMD CSF PRRS
1 + + +
2 + + +
3 + + —
4 + + —
13 + — +
14 + + +
15 + + +
16 — — —
5 — + —
6 — — —
7 — — —
8 — — —
9 — — —
2.3 讨 论
958头份猪血清样品，以正向间接血凝试验分别检测口蹄疫病毒和猪瘟病毒特异性抗体，以ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体，结果发现，猪口蹄疫免疫的平均合格率为67.7%，未达到70%的规定标准；免疫合格率达到70%的猪场有9个，达标率为56.3%（9/16）；免疫合格率高的场有2个为100% ，低至0% 1个。猪瘟免疫的平均合格率为72.8%，
达到70%的规定标准；免疫合格率达到70%的猪场有9个，达标率为56.3%（9/16）；免疫合格率高的场有1个为100% ，低的为30.6%。猪繁殖与呼吸综合征免疫的平均合格率为56.8%，未达到70%的规定标准；免疫合格率达到70%的猪场有7个，达标率为48.6%（7/16）；免疫合格率最高的场有为100% ，低的为22.5%。口蹄疫、猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征3项免疫率合格的场：6个，占37.5%；2项免疫率合格的场：3个，占18.75%；1项免疫率合格的场：1个，占6.25%；0项免疫率合格的场：6个，占37.5%。
口蹄疫、猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征是危害养猪业的重大疫病。疫苗是防控疫病的极其
重要的措施，而通过调查，预防接种疫苗后，免疫合格的场家不足60%，大部分猪场和猪群仍然处于疫病的严重威胁之中，应引起足够重视。
建议采取的措施：
（1）做好常规饲养管理，增强各猪群的抵抗力。改善饲养管理水平，降低猪的饲养密度 （2）执行一般卫生防疫措施，严防病原传入。严格消毒、隔离制度，严禁从发病猪场引进种猪，实行全进全出等。 （3）注重免疫预防接种工作 结论
（1）调查了荆州市9个县（区）16个规模化猪场3种疫病免疫效果；免疫接种合格的猪场不足60%；
（2）提出了疫病防控主要原则性措施。
参考文献
[1] 蔡宝祥．家畜传染病学(第四版)[M]．北京：中国农业出版社，2001． [2] 殷震，刘景华．动物病毒学(第二版)[M]．北京：科学出版社，1997．
[3] Hall V W．Porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS)virus: a signifcant disease of Pigs[J]．Aust Vet J，2005，83(5)：260~261
[4] Dea S，Bilodeau R, Sauvagaeu R, et a1．Virus isolation from farms in Quebc expedencing severe outbreaks of respiratory and reproductive problems[J]．Inst Denver, Colo，1991：67~72 [5]郭宝清，刘文兴，陈章水，等．应用间接免疫荧光法从国内繁殖障碍综合征猪群中检测生殖和呼吸综合征阳性抗体的研究[J]．中国兽医科技，1996，26(3)：3~5
[6] Bjorklund H, Lowings E, Stadejek T, et a1. Phylogenetic comparison and molecular epidemiology of classical swine fever virus[J]. Virus Genes, 1999, 19(3): 189~195．
[7]Grieser-Wilke I. Molecular epidemiology of a large classical swine fever epidemic in the European Union in l997-1998[J]. Veterinary Microbiology, 2000, 77(1-2): 17~27
[8] Saatkamp H W, Berentsen P B M, Horst H S. Economic aspects of the control of classical swine fever outbreaks in the European Union[J]. Veterinary Microbiology, 2000, 73: 221~237 [9] De Smit A J, Eble P L，deKluijver E P, et a1. Laboratory experience during the classical swine
fever virus epizootic in the Netherlands in 1997-1998[J]．Veterinary Microbiology, 2000，73: 197~208
[10] Vaadeputte J, Too H L. Adsorption of colostral antibodies against classical swine fever, persistence of maternal antibodies, and effect on response to vaccination in baby pigs[J]. Am J Vet Res, 2001, 62(11): 1805~181l
[11] OIE．Disease Information dated 15 July, 2005，1 8(28): 201．
[12] 杜念兴．猪瘟的回顾与展望[J]．中国畜禽传染病，1998，20(5)：317~319．
[13] 宗禾．口蹄疫暴发--英国畜牧旅游业再临严重考验[J]．2007，08，07腾讯网，http:// finance.qq.com/a/20070807/000047.htm
[14] 张伯澄．台湾岛暴发口蹄疫启迪录[J]．中国动物保健，1999，5：3~5
[15] 姜力，姜秋杰．猪“高热综合症”是目前对养猪业威胁最严重的猪病[J]．2007，2（6）：1~8
[16] 马静云，李浩波，王玲玲，等．高致病性 PRRSV的分离及其Nsp2和ORF5基因的序列分析[J]．中国兽医科学，2008，38（8）:650~657．
[17] Benfield D，Nelson E, Christopher H J. Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus proteins and antigenic variation．In：Pro 13 th Congress of Inter Pig Vet Soci，1994：62
[18] Meulenberg J M，Meijer E J, Moormann R J M．Subgenomic RNAs of Lelystad virus contain a conserved junction sequence．J Gen Virol，1993，74：1697~1700．
[19] Nielsen R, Botner A. Hematological and immunological parameters of 4.5-month old pigs infected with PRRS virus．Vet Micribiol，1997，55：289~294．
[20] Meng X J, Paul P S, Balbur P G, et a1. Phylogenetic analyses of the putative M(ORF6)and N(ORF7) genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)：mplications for the existence of two genotypes of PRRSV in the USA and Europe[J]．Arch Virol, 1995(140): 745~755．
[21] 徐 娜，李宝玉，柳纪省．猪繁殖与呼吸综合征研究进展[J]．中国动物传染病学报， 2009，17 (4) ：71~76
[22] 蔡葵蒸，张明林，柴君秀，周学，靳国琴．猪瘟疫苗免疫母猪所产仔猪的母源抗体检测[J]．中国兽医科技，2002，02：27~28
[23] 刘杰标，周立平，韦庄备等．用正向间接血凝试验检测猪瘟免疫抗体[J]．中国兽医科技，2002，32(1)：38~39
[24] 余兴龙，涂长春，李作生等．以重组mE2蛋白为抗原建立检测CSFV抗体间接ELISA方法的研究[J]．中国预防兽医学报，1999：21(3)：220~222
[25] Lin M，Trottier E．Pasick J．Antibody Responses of Pigs to Defined Erns Fragments afterInfection with Classical Swine Fever Virus．Clinical and diagnostic laboratory immunology，2005，12(1)：180~186
[26] Lin M，Trottier E，Mallory M．Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Based on a Chimeric Antigen Bearing Antigenic Regions of Structural Proteins Erns and E2 for Serodiagnosis of Classical Swine Fever Virus Infection．Clinical and diagnostic laboratory immunology，2005，12(7)：877-88 l
[27] 贾建军，李文贵，李爱云，等．猪瘟的分子生物学诊断[J]．中国兽医科技，2002，07：20~22
[28] 陆芹章，韦栋平，罗廷荣，等．RT-PCR诊断猪瘟的应用[J]．广西农业生物科学，2004：(3)：230~232
[29] 罗廷荣，莫扬，吴文德，等．RT-PCR技术检测猪瘟病毒的应用研究[J]．中国预防兽医学报，2004，26(4)：307~309
[30] 温国元，万超，潘兹书，等．应用荧光定量PCR技术快速定量检测猪瘟病毒[J]．武汉大学学报(理学版)，2004，06：746~750
[31] Ophuis R J, Morrissy C J, Boyle D B. Detection and quantitative pathogenesis study of classical swine fever virus using a real time RT-PCR assay [J]. J Virol Methods, 2006, 13 1(1): 78~85
[32] Paiba G A, Anderson J, Paton D J, et al．Validation of a foot-and-mouth disease antibody screening solid-pHase competition ELISA(SPCE)[J]．J Virol Met, 2004, 115(2)：145~158． [33] Fan L，Yeou L L, Ming H J. Comparison of ELISA for the detection of porcine serum antibodies to non-structural proteins of foot-and-mouth disease virus [J]. J Virol Met, 2004： 116(2)：155~156．
[34] Sellers R E. growth and titration of the virus of foot-and-mouth disease and vesicular stomatitis in kidneyμμtissue cultures[J]. Nature, 1995, 174: 547~549.
[35] Laor O, Torgersen H, Yadin H, et a1．Detection of FMDV RNA amplified by PCR [J]. J Virol Meth. 1992, 36：197~208．
[36] 吴时友，蒋正军，宫云浩．应用RT-PCR检测口蹄疫病毒(FMDV)的研究初报(J]．动物检疫，1991，8(6)：1~2．
[37] 朱彩珠，卢永干，邱孝高．RT-PCR检测口蹄疫病毒[J]．病毒学报，1998，14(3)：272~278． [38] 李军，林继煌，姜平，等．用免疫金技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒[J]．畜牧与兽医， 2001，33(2)：1~2
[39] 王忠，杨汉春，郭鑫，等．重组M蛋白--乳胶凝集试验检测PRRS病毒血清抗体的研究[J]．中国兽医杂志，2002，38(7)：1l~13 [40] Hoelle．用实时PCR从血清中对美洲和欧洲PRRSV实地分离株作定性和定量检测[C]．第十七届国际猪病会议论文选集，上海：2002 [41] Egli C，Thur B，Liu L，et al. Ouantitative Taqman RT-PCR for the detection and diferentiation of Europeanan and NorthAmerican strain porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J]．Virol Meth，2001，98(1)：63～75
[42] 娄高明，社伟贤．猪繁殖与呼吸道综合征RT-PCR诊断方法的建立[J]．中国兽医学报，2000，20(2)：141~144
[43] 赵耘，张广川．套式RT-PCR检测猪繁殖与呼吸综征的研究[J]．微生物学通报，2003． (6)：77~80
[44] 余兴龙，涂长春，李红卫，等．猪瘟病毒EZ基因真核表达质粒的构建及基因疫苗的研究[J]．中国病毒学，2000，1 5(3)：264~270．
[45] Hommond J M, Jansen E S, Morrissy C J, et a1. A primeboost Vaccination Strategy using naked DNA followed by recombinant porcine denovirus protects Pigs from classical swine fever [J]. Vet Microbiol，200 1, 180(2): 10l～119．
[46] Andrew M E, Morrissy C J, Lenghaus C, et a1．Protection of Pigs against classical swine fever with DNA-delivered gp55[J]. Vaccine, 2000, ，1 8(1 8): 1932~1830．
[47] Uttenthal A, Le Potier M F, Romero L, et a1. Classical swine fever(CSF) marker vaccine, Trial I Challenge studies in weaner pigs[J]．Vet Microbiol，200l，83(2)：85~106．
[48] Hulst M M, Westra D F, Wensvoort G , et a1. Glycoprotein E1 of hog cholera virus expressed in insect cells protects swine from hog cholera[J]. J Virol, 1993, 67(9): 5435~5442．
[49] Dong X N, Chen Y H. Candidate peptide-vaccines induced immunity against CSFV and
identified sequential neutralizing determinants in antigenic domain A of glycoprotein E2[J]. Vaccine, 2006, 24(11): 1906~1913.
[50] Volker K，Bodo L. Oral immunization against classical swine fever(CSF): onset and duration of immunity[J]. Veterinary Micxobiology, 2001, 82: 301～310
[51] Patricia K, Elke L, Ilona R, et a1. CP7 E2alf：A safe and efficient marker Vaccine strain for oral immunosation of wild boar against Classical swine fever virus(CSFV)[J]. Vaccine, 2007, 25(17): 3391~3399
[52] K leid D G, Yansura D, Sm all B, et al. C lon ed viral protein vaccine for foot-and-mouth disease: responses in cattle and swine [ J]. Science, 1981, 214( 4525) : 1125~1129.
[53] McKenna T S, Lubroth J, Rieder E, et al. Receptor binding sited elected foot-and-mouth disease ( FMD ) virus protects cattle from FMD [J]. J Virol, 1995, 69: 5787~5790.
[54] Song H, Wang Z. A novelmucosal vaccine against foot-and-mouth disease virus induces protect ion in m ice and swine [ J]. Biotechno llett, 2005, 27( 21 ): 1669~1674. [55] 杨",光，金香兰，房明丽，等．重组牛O型口蹄疫病毒VP1表位疫苗的构建、表达、纯化及免疫活性研究[J]．现代免疫学，2009，29 ( 3)：230~234
[56] Kupriianova M A, Zhmak M N, Koroev D O, et al. Synthetic peptide designs based on immunoactive fragments of the VP1 protein of the foot-and-mouth disease virus strain A22 [J]. Bioorg Khim, 2000, 26( 12) : 926~932.
[57] Rogan D. Full-length sequence of a Canadian porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)isolate[J]. Arch Virol, 2000, 145(11): 2297~2323
[58] 郭宝清，蔡雪晖．猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的研制[J]．中国预防兽医学报，2000，22(4)：259~262 [59] 陈建君，宋长绪．猪繁殖与呼吸综合征病毒广东株ORF5基因在大肠杆菌中的表达[J]．动物医学进展，2005，26(5)：66~68
[60] 田志军，仇华吉．表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白重组伪狂犬病毒的构建及其生物学特性分析[J]．遗传学报，2005，32(12)：1248~1255