第一章 酶工程基础
1.名词解释：酶工程、比活力、酶活力、酶活国际单位、酶反应动力学
① 酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新技术，是工业上有目的地设计一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在常温常压下催化化学反应，生产人类所需产品或服务于其它目的地一门应用技术。
② 比活力：指在特定条件下，单位质量的蛋白质或RNA所拥有的酶活力单位数。
③ 酶活力：也称为酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。其大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高。
④ 酶活国际单位: 1961年国际酶学会议规定：在特定条件(25℃，其它为最适条件)下，每分钟内能转化1μmol底物或催化1μmol产物形成所需要的酶量为1个酶活力单位，即为国际单位（IU）。
⑤ 酶反应动力学:指主要研究酶反应速度规律及各种因素对酶反应速度影响的科学。
2.说说酶的研究简史 酶的研究简史如下：
(1)不清楚的应用：酿酒、造酱、制饴、治病等。
(2)酶学的产生：1777年，意大利物理学家 Spallanzani 的山鹰实验；1822年，美国外科医生 Beaumont 研究食物在胃里的消化；19世纪30年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。 1684年，比利时医生Helment提出ferment—引起酿酒过程中物质变化的因素（酵素）；1833年，法国化学家Payen和Person用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶；1878年，德国科学家K?hne提出enzyme—从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”（希腊文）。 (3)酶学的迅速发展（理论研究）：1926年,美国康乃尔大学的”独臂学者”萨姆纳博士从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质;1930年，美国的生物化学家Northrop分离得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶结晶，确立了酶的化学本质。 3.说说酶工程的发展概况 I.酶工程发展如下：
①1894年，日本的高峰让吉用米曲霉制备淀粉酶，酶技术走向商业化： ②1908年，德国的Rohm用动物胰脏制得胰蛋白酶，皮革软化及洗涤； ③1911年，Wallerstein从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清；
④1949年，用微生物液体深层培养法进行?－淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕；⑤1960年，法国科学家Jacob和Monod提出的操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量； ⑥1971年各国科学家开始使用“酶工程”这一名词。
II.在酶的应用过程中，人们注意到酶的一些不足之处，如：稳定性差，对强酸碱敏感，只能使用一次，分离纯化困难等，解决的方法之一是固定化。 固定化技术的发展经历如下历程：
①1916年，Nelson和Griffin发现蔗糖酶吸附到骨炭上仍具催化活性；
②1969年，日本千佃一郎首次在工业规模上用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L－氨基酸；
③1971年，第一届国际酶工程会议在美国召开，会议的主题是固定化酶。
4. 酶的催化特点 酶催化作用特性有：
①极高的催化效率：在37℃或更低的温度下，酶的催化速度是没有催化剂的化学反应速率的1012-1020倍；
②高度的专一性：一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反应并生成一定的产物；
③活性的不稳定性：酶的催化反应需要温和的条件，强酸、强碱、高温等条件都能使酶破坏而完全失去活性，所以酶作用一般都要求比较温和的条件，如常温、常压、接近中性的酸碱度等；
④活性的可调节性：酶的催化活性是受调节和控制的酶促反应受多种因素的调控，以适应机体对不断变化的内外环境和生命活动的需要。其中包括三方面的调节，a.对酶生成与降解量的调节;b.酶催化效力的调节;c.通过改变底物浓度对酶进行调节等。 5.简要说说影响酶催化作用的因素
影响酶催化作用的因素有内因和外因，内因有：酶浓度、底物浓度和产物浓度； 外因有：温度、PH、激活剂和抑制剂。
① 底物浓度：当底物浓度很低时，反应速度随底物浓度的增加而急剧加快，两者呈正比关系，表现为一级反应；随着底物浓度的升高，反应速度不再呈正比例加快，反应速度增加的幅度不断下降；如果继续加大底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应，此时，无论底物浓度增加多大，反应速度也不再增加。
② 产物浓度：生物代谢过程中产生的中间产物或终产物是酶的变构剂，使酶变构而影响酶的反应速度，即反馈调节作用。
③ 酶浓度：在底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比。
④ 温度：在一定温度范围内，反应速度随温度升高而加快，一般温度每升高10℃，反应速率大约增加一倍；超过一定范围，较高温度会引起酶三维结构变化，甚至变性，导致催化活性下降，反应速度反而随温度上升而减缓。
⑤ PH：酶分子处于最适PH时，催化反应速度达最大值；当反应介质PH偏离酶最适PH，会影响酶与底物结合，进而影响反应速度，故必须控制好PH。
⑥ 激活剂：凡能提高酶活性的物质，都称为激活剂，大部分是离子或简单的有机化合物。 ⑦ 抑制剂：凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂，通常抑制作用分为可逆性抑制和不可逆性抑制两类。
6 说说米氏方程的意义
V[S]v?m这个方程即为米氏方程，是在假定存在一个稳态反应条件下推导出来的。
Km?[S]其中：Km值称为米氏常数，是酶促反应速度为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度； Vmax是酶被底物饱和时的反应速度； [S]为底物浓度。
米氏方程表示一个酶促反应的起始速度（v）与底物浓度（S）关系的速度方程。其意义为：①方程反映了反应性质、反应条件、反应速度之间的关系；
②反映了反映速度与底物浓度之间的关系，当[S]远大于Km时,反应速度与底物浓度无关; ③反映了酶反应速度与酶浓度的关系,当[S]远大于Km时,v=k2[E0]为线性关系，酶活正比于酶浓度。
第二章 酶的发酵工程
1. 名词解释：诱导物、（诱导作用）、终产物阻遏、分解代谢产物阻遏、葡萄糖效应 ① 诱导物：诱导酶起始合成的物质（通常是酶的底物），可以引起阻遏蛋白的构象变化，使之不利于与操纵基因结合，如乳糖；而能引起阻遏蛋白的构象变化从而有利于其与操纵基因结合，阻遏酶产生的物质称为辅助阻遏，如氨基酸和核苷酸等。
② 终产物阻遏：催化某一特异产物合成的酶，在培养基中有该产物存在的情况下常常是不
合成的，即受阻遏的。
③ 分解代谢产物阻遏：大肠杆菌在含有能分解的两种底物（如葡萄糖和乳糖）的培养基中生长时，首先分解利用其中的一种底物（葡萄糖），而不分解另一种底物(乳糖)，这是因为葡萄糖的分解代谢产物阻遏了分解利用乳糖的有关酶合成的结果，此作用即为分解代谢产物阻遏。
④ 葡萄糖效应：由于葡萄糖常对分解利用其他底物的有关酶的合成有阻遏作用，故分解代谢产物阻遏又称为葡萄糖效应。
2. 举例说明酶生物合成调节机制在酶发酵过程优化中的指导意义
乳糖是大肠杆菌合成β-半乳糖苷酶的诱导物，若只采用乳糖作为碳源，虽然提高了发酵单位却增加了成本。若采用葡萄糖和乳糖以适当比例组成的混合碳源，则在提高产量的同时又能降低发酵原料成本。在利用嗜热脂肪芽孢杆菌生产α-淀粉酶时，采用甘油替代果糖解除分解代谢阻遏，可以使产量提高约25倍。在利用枯草芽孢杆菌活菌生产蛋白酶时，若培养基中含有氨基酸，酶产量很低：如果除去培养基中的氨基酸，蛋白酶产量会大幅度提高。再如，枯草芽孢杆菌的鸟苷发酵是典型的代谢控制发酵，采用腺嘌呤营养缺陷型突变株。发酵过程中人为限制腺嘌呤的浓度，使细胞代谢途径中的腺嘌呤类核苷酸浓度保持在不致引起关键酶的反馈抑制和阻遏的水平，有利于鸟苷的积累。
3. 举例说明酶生物合成调节机制在产酶生物菌种改造中的指导意义
若通过基因工程手段和传统诱变的技术获得在抗代谢物存在时也能正常生长的突变株，有的突变株的相关酶系合成对这种抗代谢物不敏感，这也就解除了某些代谢物对有关酶系的反馈阻遏。例如，异亮氨酸合成途径中的关键酶——高丝氨酸脱氢酶受蛋氨酸的反馈阻遏，通过选育蛋氨酸结构类似物抗性突变株或者蛋氨酸缺陷型菌株，可提高该酶量，从而提高异亮氨酸产量。此外，在育种工作中，还可以筛选组成型菌株以提高酶的产量。以β-半乳糖苷酶的生产为例，将诱导型菌株培养在含有抑制物质邻硝基-β-D岩藻糖苷和乳糖的培养基中时，由于诱导酶的合成被抑制，野生型因不能利用乳糖而不能生长，但组成型酶突变株对于乳糖的利用则不受限制，因而此环境中生长的突变株为组成型酶产生菌。
4. 在酶的发酵过程中，提高酶产量的措施有哪些
① 添加诱导物：对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加诱导物能使酶的产量显著增加。诱导物一般分为三类：酶的作用底物，如青霉素是青霉素酰化酶的诱导物；酶的反应产物，如纤维素二糖可诱导纤维素酶的产生；酶的底物类似物，如异丙基β-D-硫代半乳糖苷对β-半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍。
② 降低阻遏物浓度：微生物酶的生产受到代谢末端产物的阻遏和分解代谢物阻遏的调节。为避免分解代谢物的阻遏作用，可采用难于利用的碳源，或采用分次添加碳源的方法培养液中的碳源保持在不至于引起分解代谢物阻遏的浓度。
③ 添加表面活性剂：在发酵生产中，非离子型的表面活性剂常被用作产酶促进剂，但它的作用机制尚未完全研究清楚。
④ 添加产酶促进剂：产酶促进剂是指那些非微生物生长所必须，能提高酶产量但作用机制尚未阐明的物质，它可能是酶的激活剂或稳定剂. 5.说说微生物产酶菌种的要求
对于生产酶的菌种来说一般必须符合以下条件： ① 酶的产量高；
② 容易培养和管理，产酶细胞容易生长繁殖，适应性较强，便于管理；
③ 菌株遗传性要稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体，保证生产的稳定性； ④ 菌株能利用廉价原料，发酵周期短，生产成本低；
⑤ 发酵产物利于酶产品的分离纯化，最好是分泌型的胞外酶；
⑥ 菌株安全可靠，不是病原菌，不产毒素及其他有害物质，不影响生产人员的身体健康；
⑦ 基因工程菌株必须符合安全性要求。
6.如果筛选酸性蛋白酶高产菌株，如何进行筛选 1 材料和方法 1.1 试验材料
1.1.1 出发菌株：黑曲霉
1.1.2 分离及斜面培养基：斜面培养基为PDA培养基和察氏培养基, 分离培养基是在察氏培养基中加入1%的酪蛋白。 （1）PDA培养基；
（2）查氏培养基：硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、琼脂20g、蒸馏水1L，加热溶解，自然PH，分装后121℃灭菌20min。
培养方法：按要求配制发酵基质，调节初始含水量和pH后，取150 g分装于1L三角瓶中，在0.1 Mpa压力条件下灭菌30 min后，冷却接种，接种量为0.3%，于不同条件下发酵84h，干燥后，进行酶活的测定。 2 实验方法
2.1 菌种的分离和纯化：采用常规稀释分离法。 2.2 菌株的诱变处理
取0.1 ml稀释的孢子悬液涂布初筛平板, 30℃培养4 h,紫外灯预热30min后，将平皿置于距15W紫外灯30 cm 处距分别照射0 s （对照用）、4 min、6 min、8min、10min、12min（各做2组）。随后在暗光条件下，用5mL无菌生理盐水对平皿上的菌进行洗脱，适当稀释后，涂布于分离平皿，以黑布包裹30℃下避光培养3-4天，从长出菌落与其水解圈直径比的大小及菌落形态的变化，挑选所需菌种，编号并保存，同时根据平皿菌落数计算致死率,从而求得成活率。
致死率（%）=（A-B）/A×100
式中：A 为对照组平皿上的菌落数；B 为诱变处理后平皿上的菌落数。 2.3 酶活测定方法
酶活定义：1g酶粉在40℃，pH值为3.0反应条件下，1分钟水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位（U/g）。 3 结果与分析
3.1 菌株选育结果
为了筛选在固体培养条件下产酶高的菌株, 经紫外线诱变处理后, 得到100余株突变株。这些菌株在形态上有一定的差异，依照其菌落的形态、菌落大小、孢子颜色和孢子丰满程度以及水解圈的大小，从中挑选出20株先经三角瓶液体发酵产酶测定,获得10个高产菌株再经三角瓶固体发酵培养复选。其中z-10的酶活最高为9284U/g（干基），比出发菌株(CK)提高了11.1倍。紫外线诱变的机理是能作用于嘧啶，形成嘧啶二聚体（主要是TT），影响DNA 正常解链与碱基配对，从而引起基因突变，提高酶产量。
7.结合酶生物合成模式，浅谈该如何提高酶的合成量 （1）遗传控制 ①诱变育种
a. 使诱导型变为组成型：选育组成型突变株
b. 使阻遏型变为去阻遏型
c. 解除反馈阻遏：选育营养缺陷型突变株、选育结构类似物抗性突变株 d. 解除分解代谢物阻遏：选育抗分解代谢阻遏突变株
②基因工程育种：改变细胞调节基因，使菌种由诱导型变为组成型；增加结构基因的拷贝数，增加细胞专一性酶的生产。
（2）条件控制
① 添加诱导物酶的作用底物、作用底物的前体、反应产物、酶的底物类似物或底物修饰物 ② 降低阻遏物浓度:
产物阻遏：除去终产物；添加阻止产物形成的抑制剂
分解代谢物阻遏：避免使用葡萄糖、避免培养基过于丰富、添加一定量的cAMP ③ 添加表面活性剂: 离子型( Tween－80),对细胞有毒害作用;
非离子型( TritonX－100),增加细胞通透性. ④ 添加产酶促进剂：酶促进剂对不同细胞、不同酶的效果各不相同，需通过试验选用适当的产酶促进剂并确定最适浓度,其作用机制并未阐明清楚。如添加植酸钙镁可使桔青霉素生产磷酸二酯酶的量提高10－20倍。
第三章 酶的分离工程
1.名词解释：ATPE，IEC，HPLC，2-DE。
2.细胞破碎的方法有哪些?原理是什么?
细胞破碎按照处理方法一般分为机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶促破碎法等。 ① 机械破碎法：通过机械运动产生压缩力和剪切力，将组织细胞打碎，具有处理量大、破碎效率高、速度快等优点。细胞的机械破碎主要有捣碎法、研磨法和匀浆法等。
② 物理破碎法：利用温度、压力、声波等物理因素，使细胞破碎的方法，多用于微生物细胞的破碎。常用的破碎方法有温度差法、压差法和超声波法等。
③ 化学破碎法：利用各种化学试剂作用于细胞膜，从而使细胞破碎的方法。常用的化学试剂有甲苯、丙醇、丁醇、氯仿等有机溶剂，曲拉通和吐温等表面活性剂。
④ 酶促破碎法：根据细胞壁结构特点，选用适当的酶、破坏细胞壁，并在低渗透压的溶液中使细胞破裂的方法称为酶促破碎法。其中在一定条件下，利用细胞自身酶系的催化作用使细胞破碎的方法称为自溶法，自溶法的作用效果受温度、PH、离子强度等因素的制约。必要时需加入适量的甲苯、氯仿等防腐剂，以防止其他微生物在自溶体系中的生长。
3. 酶的提取方法有哪些?影响酶提取的主要因素有哪些?
根据酶提取时所采用的溶剂或溶液的不同，酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。
① 盐溶液提取法：蛋白质在低浓度盐溶液中，其溶解度会随着盐溶液浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶这是因为蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度提高。
② 酸溶液提取法：有些酶在酸性溶液中的溶解度比较大，且比较稳定，这类酶宜采用酸溶液提取，PH一般控制在2—6，针对酶的性质选择合适的PH，避免PH过低引起酶失活。 ③ 碱溶液提取法：有些酶在碱性溶液中的溶解度比较大，且比较稳定，这类酶宜采用碱溶液提取，PH一般控制在8—12，针对酶的性质选择合适的PH，避免PH过高引起酶失活。 ④ 有机溶剂提取法：一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的酶蛋白难溶于水、稀盐、稀酸或稀碱中，则常用能够与水混溶的有机溶剂提取，如乙醇、丙酮、丁醇等。 酶主要是蛋白质，影响蛋白质提纯的因素同样会影响酶的提纯，而在酶提取过程中最重要的就是要防止酶的变性失活。影响酶提取的最主要因素是酶在所用溶剂中的溶解度及酶向溶剂中扩散的难易。此外，在提取过程中还要注意一下因素的影响：
1) 温度：为防止酶的变性失活，提取时温度不宜过高。特别是采用有机溶剂提取时，整个提取操作应尽可能在低温下进行。
2) PH：酶提取液的PH首先应保证蛋白质稳定，为了增加酶的溶解度，提取时溶液的PH应远离酶的等电点。