6．滴定开始时，染料溶液要迅速加入，直至红色不立即消失，而后尽可能一滴一滴地加入，并要不断摇动三角烧瓶，直至呈粉红色于15 S内不消失为止。样品中可能有其他杂质也能还原2，6 -二氯靛酚，但一般杂质还原该染料的速度均较抗坏血酸慢，所以滴定时以15 s秒粉红色不退为终点。
7．测定样品溶液时必须同时作一空白对照，样品溶液滴定的毫升数须扣除空白液滴定的毫升数。
Ⅱ 2，4－二硝基苯肼比色法
一、实验原理
总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸，样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4－二硝基苯肼作用生成红色脎，根据脎在硫酸溶液中的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色定量。 二、化学试剂
本实验用水均为蒸馏水。试剂纯度均为分析纯。
1. 4.5mol/L硫酸：谨慎地加250mL硫酸(比重1.84)于700mL水中，冷却后用水稀释至1000mL。
2. 85%硫酸：谨慎地加900mL硫酸(比重1.84)于100mL水中。
3. 2% 2，4－二硝基苯肼溶液：溶解2g 2，4－二硝基苯肼于100mL 4.5mol/L硫酸内，过滤。不用时存干冰箱内，每次用前必须过滤。
4. 2%草酸溶液：溶解20g草酸(H2C2O4)于700mL水中，稀释至1000mL。 5. 1%草酸溶液：稀释500mL 2%草酸溶液到1000mL。 6. 1%硫脲溶液：溶解5g硫脲于500mL 1%草酸溶液中。 7. 2%硫脲溶液：溶解10g硫脲于500mL 1%草酸溶液中。
8. 1mol/L盐酸：取100mL盐酸，加入水中，并稀释至1200mL。
9. 抗坏血酸标准溶液：溶解100mg纯抗坏血酸于100mL 1%草酸中，配成每毫升相当于1mg抗坏血酸。
10. 活性炭：将100g活性炭加到750mL 1mol/L盐酸中，回流1～2h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子(Fe3+)为止，然后置于110℃烘箱中烘干。
11. 检验铁离子方法：利用普鲁士蓝反应。将2%亚铁氰化钾与1%盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴入，如有铁离子则产生蓝色沉淀。 三、仪器和设备
恒温箱：37±0.5℃；可见－紫外分光光度计；捣碎机；电子天平；玻璃器皿等。 四、操作步骤
1.样品的制备
全部实验过程应避光。 1.1 鲜样的制备：称100g鲜样和100g2%草酸溶液，倒入捣碎机中打成匀浆，取10～40g匀浆(含1～2mg抗坏血酸)倒入100mL容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。
1.2 干样制备：称1～4g干样(含1～2mg抗坏血酸)放入乳钵内，加入1%草酸溶液磨成匀浆，倒入100mL容量瓶内，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。
1.3 将(11.1.1)和(11.1.2)液过滤，滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后，倾出上清液，过滤，备用。
2. 氧化处理：取25mL上述滤液，加入2g活性炭，振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10mL此氧化提取液，加入10mL2%硫脲溶液，混匀。 3 呈色反应
3.1 于三个试管中各加入4mL稀释液(11.2)。一个试管作为空白，在其余试管中加入
1.0mL2% 2，4－二硝基苯肼溶液，将所有试管放入37±0.5℃恒温箱或水浴中，保温3h。 3.2 3h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温，然后加入1.0mL 2% 2，4－二硝基苯肼溶液，在室温中放置10～15min后放入冰水内。其余步骤同样品。
4 85%硫酸处理：当试管放人冰水后，向每一试管中加入5mL 85%硫酸，滴加时间至少需要1min，需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置30min后比色。 5 比色：用1cm比色杯，以空白液调零点，千500nm波长测吸光值。 6 标准曲线绘制
6.1 加2g活性炭于50mL标准溶液中，摇动1min，过滤。
6.2 取10mL滤液放入500mL容量瓶中，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀释至刻度，抗坏血酸浓度20μg/mL。
6.3 取5，10，20，25，40，50，60mL稀释液，分别放入7个100mL容量瓶中，用1%硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1，2，4，5，8，10，12μg/mL。 6.4 按样品测定步骤形成脎并比色。
6.5 以吸光值为纵坐标，以抗坏血酸浓度(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线。 五、计算
X?C?Vm?F?1001000
式中：X——样品中总抗坏血酸含量，mg/100g；
c——由标准曲线查得或由回归方程算得“样品氧化液”中总抗坏血酸的浓度，μg/mL；
V——试样用1%草酸溶液定容的体积，mL； F——样品氧化处理过程中的稀释倍数； m——试样质量，g。 六、结果的允许差
同一实验室平行或重复测定相对偏差绝对值≤10%。
实验十 VB1的测定
一、实验内容与适用范围
本标准规定了用荧光测定法测定食物中硫胺素含量的方法。
本标准适用于各类食物中硫胺素的测定，但不适用于有吸附硫胺素能力的物质和含有影响嚷嘧色素荧光物质的样品。
本方法的最小检出限为0.05μg。 二、实验原理
硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外线下，噻嘧色素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，此荧光之强度与噻嘧色素量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。
如样品中含杂质过多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离，然后以所得溶液作测定。
三、化学试剂
1. 正丁醇：优级纯或重蒸馏的分析纯。 2. 无水硫酸钠：分析纯。 3. 淀粉酶。
4. 水：去离子水或蒸馏水。
5. 0.1mol/L盐酸：8.5mL浓盐酸用水稀释至1000mL。 6. 0.3mol/L盐酸：25.5mL浓盐酸用水稀释至1000mL。
7. 2mol/L乙酸钠溶液：164g无水乙酸钠或2728含水乙酸钠溶于水中稀释至1000mL。 8. 25%氯化钾溶液：250g氯化钾溶于水中稀释至1000mL。
9. 5%酸性氯化钾溶液：8.5mL浓盐酸用25%氯化钾溶液稀释至1000mL。 10. 15%氢氧化钠溶液：15g氢氧化钠溶于水中稀释至100mL。
11. 1%铁氰化钾溶液：1g铁氰化钾溶于水中稀释至100mL。放于棕色瓶内保存。
12. 碱性铁氰化钾溶液：取4mL 1%铁氰化钾溶液，用15%氢氧化钠溶液稀释至60mL。用时现配，避光使用。
13. 3%乙酸溶液：30mL冰乙酸用水稀释至1000mL。
14. 活性人造浮石：称取100g经40目筛的人造浮石，以10倍于其容积的3%热乙酸搅洗2次，每次10min；再用5倍于其容积的25%热氯化钾搅洗15min；然后再用3%热乙酸搅洗10min；最后用热蒸馏水洗至没有氯离子。于蒸馏水中保存。
15. 硫胺素标准贮备液：准确称取100mg经氯化钙干燥24h的硫胺素，溶于0.01mol/L盐酸中，并稀释至1000mL。此溶液每毫升相当0.1mg硫胺素。于冰箱中避光可保存数月。 16. 硫胺素标准中间液：将硫胺素标准贮备液用0.01mol/L盐酸稀释10倍。此溶液每毫升相当10μg硫胺素。于冰箱中避光可保存数月。 17. 硫胺素标准使用液：将硫胺素标准中间液用水稀释100倍，此溶液每毫升相当0.1μg硫胺素。用时现配。
18. 0.04%溴甲酚绿溶液：称取0.1g溴甲酚绿，置于小研钵中，加入1.4mL 0.1mol/L氢氧化钠研磨片刻，再加入少许水继续研磨至完全溶解，用水稀释至250mL。 四、仪器设备
1. 实验室常用仪器设备。 2. 荧光分光光度计。
3. Maizel－Gerson反应瓶：
4 盐基交换管： 五、操作步骤 1.试样处理
样品采集后用匀浆机打成匀浆(或者将样品尽量粉碎)于低温冰箱中冷冻保存，用时将其解冻后使用。 2.提取
2.1 精确称取一定量试样(估计其硫胺素含量约为10～30μg，一般称取5～20g试样)，置于150mL三角瓶中，加入50～75mL 0.1mol/L或0.3mol/L盐酸使其溶解，瓶口加盖小烧杯后放入高压锅中加热水解10.3310 4Pa(151b/in2)30min，凉后取出。
2.2 用2mol/L乙酸钠调其pH值为4.5(以0.04%溴甲酚绿为外指示剂)。
2.3 按每克试样加入20mg淀粉酶的比例加入淀粉酶。于45～50℃温箱过夜保温(约16h)。
2.4 冷至室温，定容至100mL，然后混匀过滤，即为提取液。 3 净化
3.1 用少许脱脂棉铺于盐基交换管的交换柱底部，加水将棉纤维中气泡排出，再加约1g活性人造浮石使之达到交换柱的三分之一高度。保持盐基交换管中液面始终高于活性人造浮石。
3.2 用移液管加入提取液20～80mL(使通过活性人造浮石的硫胺素总量约为2～5μg)。 3.3 加入约10mL热水冲洗交换柱，弃去洗液。如此重复三次。
3.4 加入25%酸性氯化钾(温度为90℃左右)20mL，收集此液于25mL刻度试管内。冷至室温，用25%酸性氯化钾定容至25mL，即为试样净化液。 3.5 重复5.3.1～5.3.4，将20mL硫胺素标准使用液加入盐基交换管以代替样品提取液，即得到标准净化液。 4. 氧化
4.1 将5mL试样净化液分别加入A、B两个Maizel－Gerson反应瓶。
4.2 在避光暗环境中将3mL 15%氢氧化钠加入反应瓶A，振摇约15s，然后加入10mL正丁醇；将3mL碱性铁氰化钾溶液加入反应瓶B，振摇约15s，然后加入10mL正丁醇；将A、B两个反应瓶同时用力振摇，准确计时1.5min。
4.3 重复5.4.1～5.4.2，用标准净化液代替试样净化液。
4.4 用黑布遮盖A、B反应瓶，静置分层后弃去下层碱性溶液，加入2～3g无水硫酸钠使溶液脱水。
5. 荧光强度的测定 5.1 荧光测定条件：
激发波长365nm；发射波长435nm；激发波狭缝5nm；发射波狭缝5nm。 5.2 依次测定下列荧光强度：
a. 试样空白荧光强度(试样反应瓶A)； b. 标准空白荧光强度(标准反应瓶A)； c. 试样荧光强度(试样反应瓶B)； d. 标准荧光强度(标准反应瓶B)。 六、计算 X?(U?Ub)?C?V(S?Sb)?V1V2?1m?1001000
式中：X——样品中硫胺素含量，mg/100g； U——试样荧光强度；
Ub——试样空白荧光强度；
S——标准荧光强度；
Sb——标准空白荧光强度；
c——硫胺素标准使用液浓度，μg/mL；
V——用于净化的硫胺素标准使用液体积，mL； V1——试样水解后定容之体积，mL；
V2——试样用于净化的提取液体积，mL； m——试样质量，g；
七、结果的允许误差
同一实验室同时或重复两次测定结果的相对偏差绝对值≤10%。