甘油（glycerin） 30ml
将前两者溶于蒸馏水中，然后煮沸，冷却后过滤，再加入甘油和麝香草酚。 Mayer氏苏木素的配制
苏木素 0.1g 蒸馏水 100ml 钾明矾（Potassium alum） 5g 柠檬酸（Citric acid） 0.1g 水合氯醛（Chloral hydrate）20mg
配制法：
将苏木素放入蒸馏水中，用玻棒不停地搅拌直至完全溶解，再依次加入钾明矾，柠檬酸和水合氯醛，再继续搅拌，最后加入碘酸钠，搅拌均匀，即可使用。 丽春红酸性品红液的配制：
丽春红（ponceau 2R） 0.7g 酸性品红（acid fuchsin）0.3g 冰醋酸 1ml 蒸馏水 99ml
操作方法： 1切片脱蜡至水， ○
21%高锰酸钾氧化切片5min， ○
3水洗，草酸漂白1min， ○
4水洗，蒸馏水洗，天青石蓝染5min水洗， ○
5摔去余液不用水洗，滴染Mayer氏苏木素3-5min， ○
6流水冲洗5-10min， ○
7丽春红苦味酸饱和液染5min， ○
81%醋酸水溶液洗， ○
91%磷钼酸分化切片约5min， ○
10○蒸馏水洗，
111%淡绿或者甲苯胺蓝滴染30s， ○
121%○醋酸水溶液洗切片， 1395%酒精分化，无水酒精脱水， ○
14○二甲苯透明，中性树胶封固。
46
结果：胶原纤维呈现绿色或蓝色，细胞核呈现灰黑或灰蓝色，肌肉和胞质红细胞呈现红色。 注意事项：
① Masson氏染液配完后保存时间不宜过长，如有可能，每次染色以染配为佳，如何可使
着色颜色的鲜艳性。
② 切片在各级酒精中脱水，时间不宜过长，否则会将着染的颜色脱去。
③ 切片保存所着染的颜色显长为1—2年以后会随着时间的延长而逐渐褪去，应予注意。 ④ 磷钼酸和磷钨酸在染色法中的作用各有不同，磷钼酸作用于胶原纤维，磷钨酸作用于纤
维胶]质，肌胶质，神经胶质和上皮纤维等。上述两种试剂的使用，可以促进组织有选择的染色，它们可以减少背景和核的染色，使背景清晰。
⑤ 如有可能，在组织固定时，用Zenker氏固定液固定，如此对染色效果将更好。 临床应用：
1与淀粉样物的区别： ○
胶原纤维发生病变如坏死或透明变性时，它与淀粉样物在HE染色时被染为粉红色，不好区别。应用V.G染色法，能将胶原纤维染为粉红色，而淀粉样物将被染为黄色。 2应用与间胚叶来源肿瘤的区别： ○
如纤维瘤（肉瘤），平滑肌、横纹肌瘤（肉瘤），神经纤维瘤（肉瘤）、恶性纤维组织细胞瘤等，由于都含有大量的纤维，HE染色均为红色。应用Masson氏染色法，可将胶原纤维染色蓝色或绿色，肌源性组织被染为红色。 3应用与其他慢性炎症的区别。 ○
如慢性阑尾炎，疤痕愈合时，纤维愈复病灶可被染为鲜红色或蓝绿色，SARS病患者愈合后有的肺部可出现疤痕，粘连，此时可显示蓝色或绿色。
④可用于鉴定肝硬化及创伤组织的修复程度。肝硬化时的肝组织有许多不同大小的假小叶，用上述方法显示时，可显示出不同的组织结构。V.G法可将包绕假小叶的胶原纤维染成红色，胆汗呈绿色。 小结
胶原纤维在上述的两种方汉中着染不同的颜色，如V.G着染红色，Masson氏着染蓝色或绿色。这主要取瘊于染料对组织的渗透、吸附、沉淀和反应，而染料分子量的大小是关键，分子量小的分子移动迅速，行动快，对组织的渗透性较强，能穿透较为致密的组织。分子量大的染料分子移动较迟缓，渗透力较弱，可作用于组织强求构较疏松的组织，染色时间可适当延长。
在相关的染料中，分子量从小到大依次排列是：苦味酸（黄色）：229.11；桔黄G（黄色）：452；丽春红（红色）：480.42；酸性品红（红色）：585.53；苯胺蓝（蓝色）：737.72；亮绿（绿色）：792.72；甲基蓝（蓝色）>99。[2]
染色是一个较为复杂的化学反应和物理作用的双重过程，在应用这些方法时，必须根据不同的病例，选择不同的方法，认真地操作，方能获得最佳的效果。 二、网状纤维染色
网状纤维是一种纤细的纤维。它沿着网状细胞和突起分支，并互相交织成网，因而被称为网状纤维，又因这种纤维对银的浸染着色特别显著。故又称为嗜银纤维。它主要由III型胶原蛋白构成，也具有642nm周期性横纹[1]。它主要分布于骨髓、脾、淋巴结、肝和肺等脏器。癌组织中间未见有网状纤维，但在其边缘可见有大量的网状纤维，但在其边缘可见有大量的网状纤维围绕，俗称癌巢。
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（1） 网状纤维的形成
它的形成主要是在纤维母细胞的粗面内浆网中，合成可溶性胶原。在醛糖、类脂的作用下，形成可溶性胶原，随后它被分泌到细胞外，在基质中（或在细胞的表面）通过原胶原蛋白分子间的交联，聚合成为不溶性的胶原原纤维即网状纤维。 （2） 网状纤维在组织化学上的反应
网状纤维的主要成分是网硬蛋白，在组织化学上，网状纤维和胶原纤维是容易区别的。网状纤维是分支纤细的纤维。Van Gieson 氏染色不显色或微红色。PAS反应呈现红紫色，银浸染为黑色。胶原纤维用Van Gieson氏染色为红色，PAS反应呈微粉红色。银浸染为黄色或棕黄色。
（3） 状纤维的显示
1． 染色染料技术：从网状纤维的显示，区别和效果等方面，这种技术被认为是不
可靠的，其原因是它只能跟胶原纤维区别开来。
2． 金属浸染技术：这种技术对于显示网状纤维被认为是十分可靠和广泛使用的方
法，它不但能够区别网状纤维和胶原纤维，而且可显示纤细的网状纤维。
嗜银反应（Argyrophil reaction）嗜银细胞与亲银细胞所不同的是需要一种附加的还原剂来还原，它们比亲银细胞数量多。必须注意：亲银反应中将找不到任何的嗜银细胞。
亲银反应（Argentaffin reation）亲银细胞有能力，直接地，不靠外加试剂，将银液中的银还原为一种不溶性的黑色金属银沉淀的细胞称为亲银细胞。（Cells that have the ability to directly reduce silver solution producing an insoluble black metallic silver precipitate are termed-angentaffin cells）。[3] （4） 网状纤维的显示方法
1． Gomori's法 2． Godon and sweet's法 3． Wilder's法 4． Foot's法 1、Gomori's法
（1） 试剂的配制。取10%硝酸银3份，加入10%的氢氧化钾1份，混合后产生大量的黑
色沉淀物，倒去表面的液体，保留下沉淀物，加入10-20倍或更多的蒸馏水进行冲洗，连续冲洗3次。待沉淀物清晰则可。用浓氨水逐滴加到溶液中。使沉淀物逐步溶解。待见沉淀物剩少数几颗时，再取10%的硝酸银液加入数滴，至溶液再现浑浊为止。再用氨水将其溶解，然后稀释10-15倍。即可使用。平时保存于4℃冰箱中。
（2） 操作步骤：
1切片脱蜡至水，蒸馏水洗， ○
2用0.5%高锰酸钾氧化5min， ○
3自来水洗，继用蒸馏水洗， ○
4用2%草酸漂白切片2min， ○
5自来水洗，蒸馏水洗， ○
62%硫酸铁铵媒染5min， ○
48
7水洗，蒸馏水洗， ○
8滴入氨性银溶液浸染3-5min， ○
9蒸馏水洗数次， ○
1010%甲醛液还原5-10min， ○
11水洗2min， ○
12○用核固红染色10-15min， 13○水洗10min，各级酒精脱水， 14○常规透明，中性树胶封固。
结果：网状纤维黑色，核红色，胶原纤维黄棕色。 2.Gordon 和sweets氏法 1切片脱蜡至水。 ○
21%高锰酸钾氧化5分钟。 ○
3水洗。 ○
42%草酸漂白1-2分钟。 ○5水洗。 ○
62%硫酸铁铵媒染切片10分钟。 ○
7蒸馏水洗。 ○
8氨银溶液浸染2分钟。 ○
9蒸馏水冲洗数次。 ○
1010%福尔马林还原2分钟。 ○11○自来水洗。 125%偏重亚硫酸钠处理3分钟。 ○13○自来水洗。 140.2%氯化金调色3分钟。 ○15○自来水洗。 16○如果有要求，可做对比染色，如用核固红染核。 17○脱水，透明，封固。
结果：网状纤维显示黑色，如有对比染色，细胞核显示红色，胶原纤维不着色。 试剂的配制：
取10%硝酸银水溶液5ml,逐滴加入浓氨水，至形成沉淀物，再逐滴加氨水，将初次形成的沉淀物溶解。注意氨水不能加入过多。取3%过氧化钠5ml加入，即可能产生沉淀，再逐滴加入氨水至沉淀再度被溶解。加入数滴10%硝酸银，加入蒸馏水制成50ml溶液，即可使用，贮藏于4℃冰箱中。
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3．Wilder氏法。[4] 1○
切片脱蜡至水。 21%○
高锰酸钾氧化5分钟。 3○
流水洗。 42%○
草酸处理1-2分钟。 5○
流水洗。 61%○
硝酸铀10秒钟。 7○
蒸馏水洗。 8○
氨银溶液浸染1分钟。 995%○
酒精速洗。 10○于显影液内显色1分钟。 11○蒸馏水洗。
120.2%○
氯化金调色1分钟。 13○蒸馏水洗。
145%○亚硫酸钠处理1-2分钟。 15○水洗。
16○如有需要，可作对比染色。 17○常规脱水，透明，封固。
结果：网状纤维：黑色，其余着对比染色，胶原纤维不着色。 4.Foot氏法[4] 1○
切片脱蜡至水。 21%○
高锰酸钾氧化5分钟。 3○
自来水洗。 42%○
草酸处理1-2分钟。 5○
自来水洗，蒸馏水洗。 6○
于碳酸氨银液中，在56℃烤箱内浸染40-60分钟。至切片呈黄棕色。7○
速洗蒸馏水。
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常规病理技术
特殊染色技术 理论及操作手册 组织化学技术
免疫组化染色技术
2005年3月
1
目 录 第一篇
常规标本制作程序
第一节 组织标本收集取材和固定
一、标本收集和查验程序 二、活检组织取材
（一）取材时必须注意以下问题 （二）各种器官取材的方法 第二节 尸体解剖的受理和规则
一、中华医学会规定尸检受理规则 二、尸体解剖须知
三、尸体剖检的一般常识
四、一般尸体解剖的主要步骤与要求 五、尸体剖检的取材和固定 六、科学研究材料的取材 第三节 组织固定
（一）固定的作用 （二）固定的目的 （三）固定的注意事项 （四）固定液的使用 第四节 病理常规制作程序
一、常规石蜡切片制作法 （一）组织脱水 （二）组织的透明 （三）组织浸蜡 （四）组织块包埋 （五）蜡块的修切 （六）石蜡切片 （七）裱片 （八）烘烤切片
（九）切片的普通染色
（十）苏木素的种类及其配制法 （十一）伊红染液的配制 二、超声波快速石蜡制片法 三、快速石蜡制片法 第五节 冰冻切片
（一）冷冻切片的种类 （二）冷冻切片的目的
（三）冷冻切片的制作方法 （四）冷冻切片的快速染色法 （一）MW固定组织
（二）MW快速石蜡制作法 （三）MW技术的特殊染色法 （四）MW技术的免疫组化染色法
2
第二篇
各种组织特殊染色法
一、胶原纤维染色法
1、Van Gieson染色法 2、Masson氏三色染色法 二、网状纤维染色法
1、Gomori’s氨银法 2、Godon和Swet氏法 3、Wilder氏法 4、Foot氏法 三、弹性纤维染色法
1、Weigert氏雷锁辛品红法 2、Gomori醛品红法 3、Unna地衣红技术
4、Verhoff氏酒精苏木素技术 四、横纹肌染色法
1、磷钨酸苏木素染色法（PTAH） 2、Masson氏法染色法 3、Van Gieson氏法 五、基底膜的显示
1、六氨银显示法 2、PAS显示法
3、Masson氏三色染色法 4、AFOG法
5、六氨银——AFOG联合染色法 六、纤维素染色法
1、MSB的改良法 2、PTAH法 七、细菌染色法
1、Warthin-Satamy氏法显示幽门螺杆菌 2、甲苯胺蓝染色法
3、Wade-Fite氏抗酸菌染色法
4、Grocott-Gomori氏六氨银改良法显示真菌 5、六氨银改良法显示组织胞浆菌 八、病毒包涵体染色法
1、Macchiaello氏改良法显示SARS病毒包涵体 2、Giemsa法显示多种病毒涵体
3、伊红和甲基蓝显示合胞和巨细胞病毒包涵体 九、淀粉样物的染色法
1、甲基紫法
2、改良的刚果红甲醇法 十、神经系统染色技术
（一）苏木素VG法染中枢神经 （二）神经细胞尼氏体染色
3
（三）改良的Masland、Glees方法
（四）改良的Palmgren氏法染神经纤维 （五）改良的Eger’s氏法染变性轴索 （六）改良的Loyez氏法染神经髓鞘
第三篇
组织化学及其显示法
一、色素显示法
1、硫酸亚铁法
2、Masson Fontana氨银法 二、含铁血黄素显示法
1、Perls亚铁氰化钾法 三、脂褐素显示法
1、PAS法
2、Schmorl氏法 四、钙盐显示法
1、硝酸银法 五、脂类染色法
1、苏丹III·IV联合法 2、油红法
3、苏丹黑B法
4、Schultz法显示胆固醇与胆固醇酯 六、糖类
1、PAS显示法 2、AB法
3、AB——PAS 七、核酸
1、Feulgen显示DNA法
2、核仁组成区和糖多糖复合显示法 3、粘多糖和核仁组成区双染法 八、酶组织化学
1、改良的Gomori氏硝酸铅法 2、改良的Gomori氏硝酸铅法 3、Gomoris钙钴法 4、α-磷酸萘脂法
5、磷酸奈酯AS-TR（或AS-BJ）法 6、酸、碱性磷酸酶双染色法
第四篇
免疫组织化学技术
一、免疫组织化学的意义
二、免疫组织化学技术的发展概况
（一）免疫荧光细胞化学技术 （二）免疫酶细胞化学技术 （三）非标记抗体酶法 （四）亲和细胞化学法
4
（五）碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法 （六）免疫金银法 （七）LSAB法
（八）EnVisionTM Systems法 （九）真空负压LSAB法 三、常用免疫组织化学染色方法
（一）ABC法 （二）LSAB法
（三）真空负压LSAB法 （四）EnvisionTM Systems法 （五）免疫组化双染色法（I） （六）免疫组化双染色法（II） （七）细胞培养片免疫荧光染色法
（八）真空负压、免疫荧光染色法染细胞培养片四、抗原修复
（一）为什么要进行抗原修复 （二）用什么方法进行抗原修复 1、真空负压抗原修复法 2、微波辐射抗原修复法 3、高压抗原修复法 4、隔水热抗原修复法 5、电炉加热抗原修复法
（三）抗原修复必须注意的问题 五、作好免疫组化染色必须注意的问题 六、免疫组化阳性病例的评判及相关问题 七、常用抗体的应用范围及选用
（一）常用上皮细胞及肿瘤标记物
（二）常用的时间叶源性组织及其肿瘤的检测抗体（三）肌组织及其相关肿瘤的常用抗体 （四）淋巴组织及相关肿瘤检测的常用抗体 （五）神经和神经内分泌及其相关肿瘤抗体 （六）其它
八、免疫组织化学在乳腺癌中的应用
5
① 切片固定30秒－1分钟。 ② 水洗。
③ 染苏木素3－5分钟。 ④ 分化。
⑤ 于碱水中返蓝20秒。 ⑥ 伊红染色10－20秒。
⑦ 脱水，透明，中性树胶封固。
冰冻组织1－2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。
冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等，这些方法在目前来说已很少使用，因此在这里不作阐述。
第六节 微波技术在病理技术中的应用
微波（Microwave, MW）是一种具有能量的电磁波，波长很短，仅有1mm-m间，但频率却很高，在330-300000MHZ（兆赫），由于它的频率高，可使物体内部的极性分子以每秒24.亿次的速度运动，在运动中产生瞬间热，自70年代Mayer氏首次把MW技术用于组织的固定以来，已有二十年的时间，在这时间里，人们已将MW技术广泛应用于病理技术的各个方面，如组织固定，组织脱水，组织切片的特殊染色，组织脱钙，快速组织制作，免疫组化染色等。
（一）组织固定
组织固定的目的是使组织细胞中的蛋白质发生凝固，以保存组织中原有的微细结构。以往为了达到上述的目的，常应用许多常规试剂来固定组织，如甲醛和酒精等。但是，由于这些固定液的穿透性不强，因而固定需时较长，致使某些抗原成分的丧失，虽然人们应用新鲜的组织来制作切片，以利于研究，但这样手续极为麻烦，且病例有限，做不了回顾性研究。基于上述原因，人们为了更好地保存抗原，研究了不同的各种固定组织的方法，在这些方法中，MW技术固定的组织、抗原保存较好。
1．MW技术固定各种组织所需的温度
MW是具有能量的电磁波，由于它能使物体内部的极性分子快速运动而产热，那么应用于组织固定的温度应是多少为好呢？各种组织由于各自的结构不同，分子不一，电子密度也就不一样，因而用于组织固定的温度也不一样。Bernard经过一系列的实验，认为肝、肾、肺的最佳固定温度是70℃，77℃和77℃，我们的实验认为各组织的固定温度应在60℃左右，时间2-3min为好。
2．MW技术固定是组织所需固定液的选择
本室张素娟应用临床冰冻切片所剩的新鲜组织如甲状腺、乳腺、淋巴结等组织，实验性小鼠的肝、肾、心、肺和大肠等组织，分别用甲醛、生理盐水进行固定，然后通过HE、网染、AB-PAS等特殊染色以及用免疫组化对几种抗体如CEA、EMA和L26等的标记，对其结果进行比较，结果发现生理盐水固定的组织效果最好。我们的实验也证明生理盐水固定的组织效果为最好，但应注意的是固定组织块不能太厚，时间在3min左右。
3．MW技术固定组织固定液的选择 固定液的量按传统的固定方法，应是1：20，但在固定液也不能很少，至少不少于250ml。原因之一，液体量少，容易导致沸腾，如此易使液体挥发直至干涸，使组织块破坏严重。其二是液体量多，可保持一定的温度，接受全程的MW辐射，使辐射和固定足时，使固定完全彻底。
（二）MW快速石蜡制作法
41
新鲜组织或临床门诊病例的组织（存于福尔马林固定液中）采用本法的以下列为好： 1．福尔马林（或生理盐水）MW辐射1.30-2.30min； 2．80%酒精MW1.30-2.30min； 3．90%酒精MW1.30-2.30min； 4．95%酒精MW1.30-2.30min； 5．95%酒精MW1.30-2.30min； 6．100%酒精MW1.30-2.30min； 7．100%酒精MW1.30-2.30min； 8．二甲苯MW1.30-2.30min； 9．浸蜡15-20min左右。
应用MW技术快速石蜡切片，必须注意的问题： 1．如果组织送至病理科时已用福尔马林固定液浸泡，则固定液仍采用福尔马林固定液，如为新鲜组织，可用生理盐水固定。
2．脱水剂采用由低至高浓度的酒精，以减少组织的过度收缩。
3．如果采用丙酮作脱水剂，应注意组织的收缩，因丙酮的沸点低，在MWO内容易沸腾。
4．脱水剂的量应在200-250ml间，过少容易使液体沸腾直至干涸，过多则达不到所需的温度，影响脱水效果。
5．如需在MWO内浸蜡，应注意脱水盒上的金属片，因为MWO内不能用金属等物品。 （三）MW技术的特殊染色法
特殊染色法中，有许多方法中的浸染时间，少则几秒种，多则几十个小时，下面是几种特殊染色的时间比较。
项目/时间 室温浸染时间（min） MW辐射时间（min） Grocott六胺银 70 1.5 胶性银AgNOR 40 1.5 胶性角-AB 40,40 1.5,1.0 PAS-胶性银 30,40 1.0,1.5 （四）MW技术脱钙法
将骨组织锯成小块，取一烧杯，盛100ml左右的10%硝酸，在其液面上加入20ml左右的液体石蜡，然后于MWO辐射10min左右，直至用大头针能顺利扎入为止。
应用MW技术进行骨组织脱钙，既要使组织快速脱钙，又要不使硝酸腐蚀机器，就必须注意如下问题：
1．液体不能过少，否则易沸腾导致硝酸溅洒出来。
2．液面上加上液体石蜡，以使硝酸分子溅洒出来，同时在MWO内加2杯冷水或冰块，以吸收一些热量，使温度不会过高。
（五）MW技术的免疫组化染色法
各种免疫组织化学的方法如ABC、LSAB（SP）、EV二步法等，都能用MW技术来进行，在应用MW技术时，必须注意如下问题：
1．MW辐射的时间：作为MW技术进行免疫组化染色，其辐射时间各有不同，这应看所使用的MWO型号及其功率，大功率的时间应相对较少。
2．MW辐射的温度：应用的MWO如为家用MWO，其温度将不好控制，MW技术免疫组化染色，温度过高，将会导致染色的失败。免疫组化加入的抗体，最多为100μl（这如果用手工操作，至少可作3例）当温度过高时，抗体很容易被蒸发至干涸，此时应在MWO内放置一些冰块或用三角烧杯或瓶装的冷水，以吸收MW辐射产生的热量，使染色能顺利
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进行，一旦加入抗体被热量所蒸发干涸，染色将告失败，应重新切片，决不能使用干涸的切片，因这种切片的抗原已失活。
3．MWO内禁用一切从属和从属性的东西，否则容易操坏仪器。 参考文献
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10．赵甲治。生物学。北京师范大学继续教育学院。亚洲开放教育学院印刷。1998；1
43
第二篇
各种组织特殊染色法
一、胶原纤维：胶原纤维是人体中的结缔组织的主要成分，分布在全身的各个部位，组成胶原纤维的主要成分是胶原蛋白。新鲜时呈白色，故一般称为白色纤维。在HE染色中被染为淡红色。它的性质是具有一定韧性及紧固性，因此它能够抵抗一定的牵拉力而不至于撕裂或拉断它们常聚集成粗细不等的束，呈波浪状。胶原纤维由许多根纤细的胶原纤维组成。在电镜下胶原原纤维又由更细的原纤维构成。根据Kramen和Little所进行的电镜研究证实，胶原纤维是特有的，具有横纹的（重复期为650?）原纤维。当有病变时这些纤维可发生变形，常出现的就是胶原纤维的坏死，胶原纤维在稀酸里可发生膨胀，变成胶样物。它们能被酸性染料染成深浅不一的粉红色，这些往往跟淀粉样物难以区别。由于它们的屈光率较弱，因而在光学显微镜下，很难与纤维区别。胶原纤维的分子长度约为3000?，直径约为14?，分子量为300000。
（1）胶原纤维的组成：
1、细胞内合成前胶原蛋白分子，成纤维细胞摄取合成蛋白质所需的氨基酸，包括脯氨酸、赖氨酸和甘氨酸。在粗面内质网的核糖体上按照特定的胶厚mRNA的碱基序列，合成前α-多肽链。后者边合成边进入粗面内质网腔中，并在羟化酶的作用下，将肽链中的脯氨酸和赖氨酸羟化经羟化后，三条前α-多肽链互相缠绕成绳索状的前胶原蛋白分子。溶解状态的前胶原蛋白分子，两端未缠绕，呈球状构形，在粗面内质网腔风或转移到高尔基复合体内加入糖基后，分泌到细胞外。
2、厚胶原蛋白分子的细胞外聚合。细胞外的前胶原蛋白分子，在肽内切酶的作用下，切去分子两端球状构表部分，形成厚胶原蛋白分子，粗约1.5nm，长约300nm，厚胶原蛋白分子平行排列聚合成胶原纤维。聚合时，相互平的相邻分子错开1/4分子长度，同一排的分子，菌尾相对并保持一定距离，聚合成束，于是形成具有64nm周期横纹的胶原原纤维。聚合时，分子内，分子间的化学基因进行缩合，交联，增加厚纤维的稳固性。若干胶原原纤维经糖蛋白粘合成粗细子等的胶原纤维。中性自溶型胶原（neutrla-soluble collagen）→醛糖、缩醛类脂/肉豆蔻酸、类脂→不溶型胶原（insoluble collagen） （2）胶原纤维的显示：
胶原纤维在HE染色法被染成粉红色，除此之外，它还可以用一些阴离子的染料来进行染色，如用淡绿可把它们染为绿色，用甲苯胺蓝可将其染为蓝色，在网状纤维染色中，如不加以处理，它又可被染为棕黄色。常用的特殊染色法有Van Gieson.Masson和Mallary等方法。在免疫细胞化学染色中，胶原纤维由于含的负电荷过多，常导致某些非特异性的染色，应特别注意。
1.Van Gieson（V.G）染色法 I. 试剂的配制： weigert氏苏木素
A液： 苏木素 1g （haematoxylin） 无水酒精 100ml
B液： 30%三氯化铁 4ml （ferric chloride） 蒸馏水 95ml 盐酸 1ml II．Van Gieson氏液
A液： 酸性品红 1g（acid fuchsin） 蒸馏水 100ml B液： 苦味酸饱和水溶液，（1.22%）（picric acid）
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注意事项：
1Weigert氏苏木素临用前取A液和B液等份混合，几个小时内用完，最长不得超过一天。 ○
2苏木素配后经二十多天才能成熟，必须提前配制。 ○
3该液能抵抗弱酸性染液，对已着染的细胞核在酸性染液的作用，不易被脱去颜色，如果不○
特别深染，则无须分化。
4Van Gieson氏液取B液9ml，加入A液1ml，即可使用。 ○
操作方法：（后面的各种方法，如没特别说明，都在室温下进行） 1切片脱蜡至水， ○
2用Weigert氏苏木素染20min， ○
3水洗，必要时可分化， ○
4流水冲洗10min， ○
5染Van Gieson氏液1min， ○
6用95%酒精快速分化， ○
7无水酒精脱水，二甲苯透明，封固。 ○
结果：胶原纤维：鲜红色，
肌纤维： 黄色， 红细胞： 黄色，
细胞核： 蓝黑或灰色。
注意事项：
1该法染完的切片，较易褪色如需照相，应尽早完成。 ○
2苏木素染液如为棕色或沉淀，应将其抛弃。 ○
3分化用的酒精，应使用95%以上的酒精，低浓度的酒精褪色能力强，容易将着染的红色○脱去。
4切片也可以用天青兰苏木素替代Weigert氏苏木素，染核效果基本一样。 ○
2.Masson氏三色染色法： 天青石蓝液的配制：
天青石蓝（Celestin blue B） 1.25g 硫酸铁铵（ferric ammonium sulfate）1.25g 蒸馏水 200ml
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?95%酒精1min。 ?90%酒精1min。 ?80%酒精1min。 ?自来水洗1min。
?浸入苏木素染液浸染10-15min。 ⑴自来水洗30second-1min。 ⑵1%盐酸酒精分化30second。 ⑶流水冲洗15min以上。 ⑷1%伊红酒精染3-5min。 ⑸90%或95%酒精分化30sec。 ⑹95%酒精30sec-1min。 ⑺95%酒精30sec-1min。 ⑻95%酒精30sec-1min。 ⑼100%酒精1min。 ⑽100%酒精1-2min。 (21)碳酸二甲苯1min。 (22)二甲苯1-2min。 (23)二甲苯1-2min (24)二甲苯1-2min。 中性树胶封固。
结果：细胞核被染成深蓝黑色；细胞浆被染成粉红色；软骨及钙盐被染成蓝色；胶原纤维染成淡粉红色，嗜酸性细胞及嗜酸性颗粒呈鲜红色；弹力纤维呈淡粉红色；某些蛋白性物呈粉红色等。
结果：
染色时的注意事项：
① 切片用二甲苯脱腊，应视不同的季节有不同的脱蜡时间，在夏天，室温较高，
脱蜡较迅速，往往在2-3min就可脱蜡干净，二在冬季，时间应相对延长。 ② 切片在进入二甲苯前，可用电吹风吹切片，使切片上的蜡处于熔解状态，这
样脱蜡较迅速，尤其是冬天，此法更可行。
③ 切片上的蜡一定要清除彻底干净，否则将影响染色，造成切片染色不均的现
象。
④ 切片进行无水化处理，这一步骤，一是可增加切片的附帖，二是可延长苏木
素的使用寿命。切片用二甲苯脱蜡后，不能直接水洗，因二甲苯不溶于水，必须经过酒精，酒精可溶解二甲苯，又能与水混合，按照以前教科书的要求，切片在整个染色过程中，都不要让其干燥。经过多年的实践及经验，笔者认为，切片用酒精将二甲苯彻底消除后，在进入苏木素染液前，可用电吹风吹干，这一步对于切片没有充分的烤片时间，对于血块等的切片来说，尤为重要，切片经此步骤，增加了附贴的牢固性，减少切片在染色过程中脱离载片的机会，保证了染色的成功率。另者，切片进入苏木素染液全无水，可保证了苏木素染液的浓度和PH值，延长其使用寿命。以往切片进入苏木素染液前，都须经水洗，每次染色，都带入不少的水分，稀释了苏木素染液的浓度，改变了它的PH值，使染液寿命缩短。 ⑤ 切片无水化除了用电吹风外，还可用火烧，切片用90%酒精洗后，取出切片，
用火轻烧，也可达到切片的无水化。火对切片有损害吗？否，经实验证明，
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切片火烧时最高温度为80℃左右，对切片没有影响。用火烧时必须彻底清除二甲苯，因为二甲苯燃烧时可产生浓烟，如果存留于切片，将会影响观察。当然，用火时应特别注意防火，因为病理技术室的大部分试剂都为易燃品。 ⑥ 苏木素染液中的最佳染色时间，确切地回答还是比较困难的，因为各种组织
都有不同的染色时间，核的染色时间从30sec至15min不等。对于核的染色，为了充分地显示各种核染色质，一定要过染，尤其对于初学者来说，更是如此。
⑦ 苏木素染液有多种，常规应用的通常为明矾苏木素，明矾苏木素又有Harris
苏木素，Mayer’s苏木素，和Ehrish苏木素等。
⑧ 盐酸酒精分化切片，浓度有0.25%,0.5%和1%根据各人的情况而使用。这一
步主要是将过染的颜色及不该染的染色去除掉，这一步要掌握得当，必须靠经验，核的染色清楚与否靠分化这一招，分化过度，核染色淡，分化不足，核染色质一团，分不清。初学者应于显微镜下控制分化程度。
⑨ 水洗蓝化，也可用温热水来促使切片蓝化，可用氨水，碳酸锂等化学药品来
促蓝，虽然如此，自来水冲洗蓝化切片是最好的，这对于切片的保存较为有利。
⑩ 伊红酒精浓度有0.25%,0.5%和1%之分，根据各单位的情况而定。切片一放
入伊红染液，即可马上着色，但是，要染好切片，必须染够染足时间。⑴分化伊红须用浓度较高的酒精，以往伊红染色以后，用低浓度的酒精分化，洗去多余的染液，实践中发现低浓度的酒精褪色能力特强，如果掌握不好，染上的伊红，便会被褪去大部分。改用较高浓度酒精后，这种现象便不会出现。
⑵作为切片脱水剂的酒精，要经常更换，尤其是无水酒精，更要保持其无水性。否则切片脱水不干净，含有水份就会褪色。切片取出后，不能令其干涸，即刻进行下一步。 ⑶碳酸二甲苯，对于南方地区来说，是一种很有用的试剂，碳酸吸水性强，用它可加强脱水，它是二甲苯与酒精之间的缓冲剂，切片经此试剂后更加透明和光亮。有人认为碳酸为一种弱酸，切片用它后可能会褪色，这种担心是多余的，切片褪色，最主要是切片本身含有水份所导致。根据我们的实验，82年的切片经碳酸处理后，17年来颜色仍然保持鲜艳就足以说明。
⑷二甲苯须换三次，以确保切片的透明度，这对于切片的观察和保存，都大有好处。 ⑸封片时要做到：切片从二甲苯取出后，不使切片干涸。如果干涸，由于空气潮湿，封片时就保证不了切片的无水。如果切片上保留着一定量的二甲苯，二甲苯的特性不溶于水，它的存在使切片与空气隔开，切片无法跟潮湿空气接触，就可保证切片的无水，这时及时滴上中性树胶，切片就能完好地封好。
⑹封片用的中性树胶，不能过稠，也不能过稀，过稠胶难以伸展开，并容易产生气泡，影响封片的速度。过稀是因胶中含过多的二甲苯，封完切片后，胶一收缩及二甲苯挥发，切片就不能被完全封盖上，这都影响切片的质量。
2.卧色自动染色机染色方法及步骤
自动染色机应用于病理切片的染色是近几年的事情，目前国内仅有少数单位拥有自动染色机，南方医院自1997年引进英国Shandon公司研制的Varicstain TM xy多程序全自动染色机以来，已完成活检HE染色和脱落细胞染色。
应用该机染片的优点
①该机全全部由电脑控制，可设置20种操作程序，任意设定各种时间。
②有21个装试剂的罐，其中2个为自来水冲洗罐，切片前水洗和苏木素染色后水洗以及盐酸分化时的水洗，都在这两个罐中进行。
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③该机配有多种不同的染色架，根据工作量的不同，自行选择，其中最大容量为6张切片。
④该机设置自动操作手臂，可在设置的范围内朝不同的方向和位置到达任何一个染色罐，朝上下活动。
⑤染色罐可多套配备，作多种染色，如组织学的HE染色，细胞学的巴氏染色等。 根据我们的应用情况，现将我们的染色程序列表如下： 自动染色机工作程序一览表 水 21（6+1） 10-30sec 15min 水 20 20sec 盐酸酒精 19 10sec 90% 6 30sec 苏木素 7 10-15min 二甲苯 18 2min 95% 5 30sec 伊红 8 3min 二甲苯 17 2min 100%alc 4 30sec 90%alc 9 30sec 二甲苯 16 1min 100%alc 3 30sec 95%alc 10 30sec 二甲苯 2 3min 95%alc 30sec 二甲苯 1 5min 100%alc 30sec 100%alc 13 1min 碳酸二甲苯 100%alc 15 14 1min 2min 注意事项
①表中二甲苯的脱蜡时间，可根据季节不同，可随意更改。
②由于为机器操作，切片无法作无水化处理，因此切片在入水洗前要充分去二甲苯。 ③切片入苏木素染色前必须水洗，但在表中没有专门供这一次水洗的罐子，在表里21号中注有（6+1）的字样，在程序输入时必须将其输入，否则将没有冲洗这一步。因为整个染色过程，需要三次水洗，而机器的固定水洗罐只有两个，因此罐的使用可以重复使用。
④机器虽然在每一步中，在进入下一罐前设有一定的时间，目的是将试剂控干后再进入下一个缸，虽然如此，还是带一定的试剂进入下一缸。
⑤苏木素要经常观察，发现染核不好，就必须马上更换，因为水洗后的切片可带入水份染液，可稀释染液的浓度。
⑥苏木素最好设置在靠近水洗缸的旁边。如果设置在远离水缸的一边，当要水洗时，由于切片从提蓝中提起，经长途输送方能到达水缸，虽然切片有控干的时间，但仍不够，还会有些许染液滴下，这样会污染机器。
⑦切片脱水用的100%alc也可设置两个缸，根据实际情况使用。
⑧碳酸后所设置的三个缸为二甲苯，目的是使切彻底得到透明，当然两个缸也可以，但效果没有三个缸的好。
⑨切片经一个程序完结后，搁置在所设置的二甲苯最后一缸，如没有去妄动它，它将永远不起来。
3．酒精灯加温快速染色法及步骤 该法可用于临床快速冰冻切片，快速石蜡及某些快速诊断的切片。它不象常规染色法那样，各种步骤都需要一定的时间。快速染色不但要求要快，而且染色质量要好，否则将给诊断造成困难。
①所有切片包括冰冻切片和石蜡切片都须用电吹风吹，使切片附贴牢固。石蜡切片还须经过快速脱蜡，切片经电吹风吹一定时间后约（1min左右），即刻浸入二甲苯，此可见成片的石蜡溶解于二甲苯中，取出切片再用电吹风吹，然后再浸入二甲苯，如此反复2-3次，石蜡即脱干净，酒精洗后，继用电吹风吹干。
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②用滴管滴染苏木素染液于切片上，在酒精灯上加热染色。加热时要来回移动切片，不要在一个点上加热，否则染色不均匀，一点加热的地方容易将切片掀起来，导致切片脱离载片。当加热的苏木素染液有蒸汽出现时，即可停止染色（时间约为30sec-1min）。
③倾去余液，急洗，速分化，水洗。将切片浸入70℃左右的热水中返蓝约30sec-1min。 ④速染伊红，切片浸入伊红液即可，后速往下酒精至切片封固，整个染色过程约4min左右，其结果与常规法同。
4．超声波快速染色法及步骤 ①切片处理同3法①。
②用一小烧杯，将入苏木素染液，浸入超声波的工作范围内，开动超声波计时表30sec，染色即可完成。
③取出切片，速水洗，分化，浸入热水或于超声波工作范围内超声20sec，速染伊红直至封片。
结果同常规染色法
两种快速染色法染色时的注意事项：
①切片要附贴牢固，薄切片是很重要的，如果切片过厚，加热染色时，切片容易翻起脱离载片，导致染色失败。
②超声波快速染色原理见（超声波快速石蜡制作程序）。 （十）苏木素的种类及其配制法 苏木素是一种天然染料，它的获得是从苏木素的树心提炼而成的，市售略带浅褐色结晶，易溶于酒精和甘油，较难溶于水，需加热才能溶解。苏木素产生于墨西哥的坎佩切，国内使用的几乎都为进口。
苏木素作为单一的染色是不行的，它染色力弱，必须具备两个条件才能具有强的染色力。一是产生有效成分苏木红，二是加入媒染剂。苏木红的产生需经氧化才能获得，获得苏木红有两种方法，一是天然成熟，苏木素与其它试剂混合好后，暴露于阳光或亮处，在自然光的作用下，慢慢地氧化成熟，但时间较长，一般需四周左右。二是加入化学试剂促进成熟，如加入黄色氧化汞或碘酸钠促使苏木素成熟。快速成熟的苏木素溶液有的可马上使用如Mayer氏苏木素，有的则需隔天使用。
苏木素种类较多，用法各异，有的用于常规染色，有的则用于特殊染色。 （1）明矾苏木素
1．Harris氏苏木素（1990） 苏木素 2.5g 无水酒精 25ml 硫酸铝钾（钾明矾） 50g 或硫酸铝铵（铵明矾）
蒸馏水 500ml 黄色氧化汞 1.25g 冰醋酸 20ml
该溶液为当前最广泛使用的染液，由于它染色时间短，效果好，很受使用者的欢迎。 配制时，先将苏木素溶于酒精（平时也可将苏木素以10%的浓度溶解好，贮存备用），取一2000ml的三角烧瓶，倾入钾明矾，加入蒸馏水，于电炉上加热，熔解钾明矾，完全熔解后，待温度至90℃左右时，加入预先溶解好的酒精苏木素，继续加热至沸腾，延续3-5min，此时溶液逐渐加深，变为紫红色，拔离电源，加入黄色氧化汞，当充分氧化后，重新插上电源继续加热3-5min，此时溶液变深紫色，拔去电源，直接将三角烧瓶插入预先备好的冰水里，放于暗处，第二天过滤后加入冰醋酸，即可使用三个月，但据我们的实践及多年的经验
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认为，只要掌握好切片的“无水化”，该染液可反复使用达一年之久（天天使用）。
注意事项：
①苏木素一定要预先溶解，否则较难彻底溶解。 ②加入黄色氧化汞后，可产生大量的气泡，因此，配制500ml的溶液，一定要选择2000ml以上的容器，否则液体便会溢出。
③当溶液变为深紫色后，应终止氧化，烧瓶应直接插入冰水中，不要担心玻璃瓶会爆裂，因三角烧瓶经特殊处理的，不会有爆裂的危险，如果有，那是属于产品质量问题。迅速冷却的主要目的是不让溶液过度氧化，以免缩短溶液的使用寿命。
④溶液过滤后方加入冰醋酸，不要颠倒过来，加入冰醋酸后再过滤，如果这样，过滤速度将非常慢，这是因为醋酸会使滤纸中的纤维膨胀，增加了密度，使溶液不易通过，导致过滤时间延长。
⑤该苏木素在使用一段时间后，可以在表面产生金属膜。当出现这种现象时，可用粗滤纸捞去，否则贴于切片上将较难除去。
⑥苏木素加入冰醋酸后，其PH值在2－2.28之间。 2．Mayer苏木素（1903） 苏木素 0.1g 蒸馏水 100ml 硫酸铝钾 5g 柠檬酸 0.1g 水合氯醛 5g 碘酸钠 20mg
该试剂有的单位用作常规切片的染色，用它染核不会过染，时间可在20min至30min，核染色质清晰可见，核呈灰黑色，可用作特殊染色核的对比染色试剂。如颗先用天青石蓝为媒染剂，染色时间可在2-3分钟完成。
配制溶液时，先将蒸馏水稍加温，加入苏木素并不停搅拌直至完全溶解，继而加入硫酸铝钾，令其充分溶解后，加入柠檬酸和水合氯醛，继续搅拌均匀，全部溶解后再加入碘酸钠，搅拌均匀，此时溶液的颜色变为深棕色，过滤后即可使用。
3．Ehrlich氏苏木素（1886） 苏木素 1g 无水酒精 50ml 甘油 50ml 硫酸铝钾 7.5g 蒸馏水 50ml 冰醋酸 5ml
将苏木素溶于无水酒精里，硫酸铝钾溶于蒸馏水中，然后所有的试剂都加在一起，充分搅拌均匀后，放于窗台上阳光充足的地，让其慢慢氧化成熟，大约需四个星期，才可使用。该液 量种很好的细胞核染色液，用它染后，细胞核染色清晰，不易过染。对于用酸脱钙组织细胞核的染色，该试剂优于其它各种苏木素。这种自然氧化成熟的苏木素，可长期使用，不会变质。但染色时间较长，需要20分钟以上。
如需急用而苏木素又未成熟时，该液可加入20-30mg的碘酸钠，以促使其迅速氧化成熟，但这试剂配成后，就不是原来的苏木素，不能长期使用，但起码可用半年左右。
4．Carazzi氏苏木素（1911） 苏木素 0.5g 甘油 100ml
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硫酸铝钾 25g 蒸馏水 400ml 碘化钾 0.1g
将苏木素溶于甘油，硫酸铝钾溶于300ml的蒸馏水中搅拌至完全溶解后，混合两液，将碘化钾溶于剩余的100ml蒸馏水中，加温到溶解后，混合于上述的混合液中，搅拌均匀，过滤后即可使用，染色时间10min左右，配成后的液体可保存半年左右。
5．Cole氏苏木素（1943）
苏木素 1.5g 饱合硫酸铝钾水溶液 700ml 碘酒（1克碘溶于95%酒精99ml中） 50ml 蒸馏水 250ml
将苏木素溶于加温的蒸馏水中，然后加入碘酒溶液，继而加入饱和硫酸铝钾溶液，混和均匀后加热，直至沸腾，将瓶子插入预备的冰水中，如同配制Hari氏苏木素一样，第二天过滤，即可使用，染色时间为20min以上。
（2）铁苏木素
1．Weigert氏铁苏木素
A液： 苏木素 1g 无水酒精 100ml
将苏木素溶于酒精，让其慢慢氧化成熟，约四周以后，便可以使用，或者用成熟的10%的苏木素酒精配制，即时可用。
B液： 29%三氯化铁水溶液 4ml 蒸馏水 95ml 盐酸 1ml
临用时，取A液和B液等份混合，即可使用，在4小时内使用完毕，如果超时，这种试剂便过分氧化而失效。因此，每次使用，需要多少配制多少，采取一次性用完，以免造成浪费。该染液具有抗弱酸的能力，因此，常用于某些特殊染色核的染色，染色时间为20-30分钟。
2．Heidenhain氏铁苏木素（1896） A液： 苏木素 0.5g 无水酒精 10ml 蒸馏水 90ml
将苏木素溶于无水酒精，然后再加入蒸馏水，放置四周后便可成熟。 B液： 硫酸铁铵 5g 蒸馏水 100ml
这种铁苏木素可以显示多种物质如：横纹肌、髓鞘、线粒体、细胞核等，可被染为深灰色至黑色。
（3）钨苏木素
磷钨酸苏木素（PTAH） 苏木素 0.5g 磷钨酸 5g 蒸馏水 500ml
取300ml蒸馏水来溶解苏木素，其余的蒸馏水溶解磷钨酸，然后两者混合在一起，搅拌均匀后放于亮处，约四周左右才可成熟使用。
该试剂可以显示多种物质，如：横纹肌、神经胶质细胞、纤维、纤维素、髓鞘、胶厚，
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和细胞浆等，染色时间24小时以上。
这种试剂配成后，可连续使用达数年时间。 （4）钼苏木素
磷钼酸苏木素（Thomas, 1941） A液： 苏木素 2.5g 二噁烷 49ml 过氧化氢 1ml B液： 磷钼酸 16.5g 蒸馏水 44ml 二甘醇 11ml
将B液过滤，取滤液50ml加到A液中去，充分混合后，可见该试剂为深紫色，放置24小时后，才可使用。染色时间2分钟。它可显示的物质为：胶原及粗的网状纤维；亲银细胞；核、Daneth氏细胞等。
（5）铅苏木素（Solcia等，1969） 硝酸铅苏木素
A液： 1.5克苏木素溶于10ml 95%酒精中，取 1.5ml 硝酸铅贮存液 10ml 蒸馏水 10ml 混合上述液体，搅拌均匀后，静置30分钟后过滤。
B液： 5%硝酸铅水溶液 50ml 饱和醋酸铵水溶液 50ml 混合两液，过滤，再加入甲醛2ml。 将A和B液混合，反复搅拌后放置30分钟，过滤后可使用。染色时间37℃ 2-3小时，45℃ 1-2小时。
该试剂可将内分泌颗粒和APUD细胞颗粒显示出来，同时也可把肌肉和神经等显示出来。
（十一）伊红染液的配制
在普通染色法中，有了细胞核的染色还不够，还不能完整地显示整个细胞来，只有同时将细胞浆显示出来，细胞才完整。因此伊红的染色也与苏木素同等重要，就如同人的左右臂，缺一不可。
配制伊红，有许多种方法，根据各单位的情况，使用不同种类的伊红。
市售的伊红有两种：一是水溶性伊红，二是醇溶性伊红，在我们的实践中，水溶性伊红用低浓度的酒精来配制，只要配制得当，其效果非常好。
伊红 1g 70-75%酒精 100ml
先将伊红用蒸馏水(少许)调成浆糊状，再加入酒精，边加边搅拌，直到彻底溶解，此时试剂有些混浊，取少许冰醋酸，加入到试剂中去，试剂逐渐转变为清亮，呈鲜红色，染出切片，效果很好。
二、超声波快速石蜡制片法 临床活检，用常规石蜡制片法制作，病理报告如没特殊情况，一般都需要三天才能发出。其程序基本是活检当天下午取材，晚上组织脱水及浸蜡，第二天上午包埋切片及染色，当切片送达医生手里时，已是第二天的上午，下午看阅切片，至复检医生手里时，已是第三天的时间了。这是一般的工作时间，可这对于急需获得病理结果的患者来说，三天时间确实太长，尤其是门诊病人，远道求医的患者，或者外地甚至国外的患者，三天的时间就意味着等待，
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住宿及消费。为了解决上述的问题，减少患者的经济负担，为患者蠃来保贵的治疗时间，超声波快速石蜡制片法可胜任此项工作。
超声波的工作原理：超声波的高频振谐下以每秒80万次作缩张运动，在此掁谐下，也促进了被超声波所作用的试剂中分子的运动。由于分子运动加快，加速了组织与各种试剂的反应，使整个操作程序在短时间内完成。
超声波快速石蜡制片法程序： 几种不同组织处理时间表(mins)
步骤与试剂 肠粘膜 鼻咽部粘膜宫内膜等， 胶原纤维较多组织
1．10%缓冲褔尔马林 4 5 10 2．丙 酮 3 5-7 10 3．丙 酮 3 5-7 10 4．二 甲 苯 3 5-7 10 5．石 蜡 5 7-10 15 （3）注意事项：
1．本法中所用的脱水剂为丙酮，它比酒精具有更强的脱水作用。虽然从理论上讲，它对组织具有很强的收缩作用，但为了能在短时间内使组织能够彻底脱水，不得不首选它。从已做的近千例次的实验中认为，它与常规切片相比较，没有什么区别。
2．有人提出，既然要快，何不用冰冻切片来制作，对于这个问题，肯定的回答是不能。因为冰冻切片与石蜡切片不一样，虽然目前机器及技术都是一流，制出切片近似于石蜡切片，但还是达不到石蜡切片的好，切片不能作长期保存，这就会影响档案的保管和资料的积累。
3．为了减少组织的收缩，脱水剂第一缸用酒精代替，但为了使组织获得彻底脱水，时间要相对延长些。
4．丙酮沸点较低，70℃左右就会沸腾，如此挥发较快，因此组织脱水时，注入丙酮的量要够，否则很容易使其干涸。
5．操作时要仔细观察，组织如果没到编程的时间，就已浮于脱水剂的上面，说明组织已经彻底脱水，可提前进入下一步。
6．切片后的染色，可用超声波来染色。(见染色篇) 三、快速石蜡制片法 这是一种传统的制作法，在有的单位或者没有配备超声波快速石蜡处理仪的情况下而又急需诊断的一种制作法，较适合于小组织的制作。
（1）胃、肠粘膜组织快速制作法 1．10%缓冲福马林5 mins。 2．80%酒精5mins。 3．90%酒精5mins。 4．95%酒精5mins。 5．100%酒精5mins 6．二甲苯 5mins 7．石 蜡 15mins 注意事项：
1．全部步骤都在65℃的恒温箱中进行。
2．浸蜡也可在酒精灯上进行，但要小心，浸蜡温度过高，也可导致组织变脆。
3．包埋时，可用预先制作的蜡模(这样可节省石蜡硬化的时间)用镊子在酒精灯上烧红，然后点于蜡膜上，将组织放进去，然后放入冰箱的冰枚中冻起来，即可切片。
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4．如遇取材多个部位多块组织时，就不能用上述的方法，否则多块组织包在一起时，不能处于同一水平面上，不利于切全组织。
（2）鼻咽部粘膜、宫内膜及穿刺物快速制作法。 1．10%缓冲福马林固定 5-10mins。 2．80%酒精 5-10mins。 3．90%酒精 5-10mins。 4．95%酒精 5-10mins。 5．100%酒精 5-10mins。 6．二甲苯 5mins。 7．浸蜡 20mins 注意事项：
上述步骤都于65℃恒温箱中进行。 第五节 冰冻切片 (一)冷冻切片的种类
冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。
(二)冷冻切片的目的
（1）在手术进行中，突然发现病人的病变与原诊断，原定手术方案不相符合，或者怀疑时，需要病理确定。
（2）了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗措施。
（3）对于已确定为恶性肿瘤的患者，则需要了解其手术范围是否足够，上下切缘是否有残存的肿瘤组织。
（4）在做剖腹探查时所发现的肿块或者异样的组织。
（5）显示组织中的脂肪和脂类物质，这常见于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研组织等。
（6）某些酶的显示如ATP酶，琥珀酸脱氢酶等。 （7）神经病理学技术中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。
（8）对某些物质所进行的免疫荧光的研究。 （三）冷冻切片的制作方法
（1）低温恒冷箱冷冻切片制作法
1．本室现有Shandon As 620 E型恒温箱冷冻切片机的主要性能。该机的箱面上有电子控制板，装有即时冷冻键和除霜键，启动即时冷冻键，机器马上进行工作状态，并可持续10mins。启动即时除霜键，可将工作间顶部后面的制冷栅上的霜除掉，并可持续15mins。有照明键一个，启动该键可照明工作间，有利工作及观察组织的冰冻状况。配有消毒键一个，当进行一周的工作或者一天的工作后，启动该键，可对工作间进行消毒。当每天工作完毕时，可启动密锁键，锁住工作间。除此之外，箱面的左边有四个按键，两个为快速自动进退键，两个为微小进退键，还有一个手动旋钮，调节修组织块时的进退。
冷冻箱内左边的冷冻台，温度可达-60℃左右，冷冻箱的中间为一台切片机，工作间的温度在0-30℃间可任意调节，并在箱面上的荧屏显示出来。
2．操作方法及步骤：
①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好
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为24×24×2mm。
②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。
③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 ④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。
⑤调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。
⑥应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- -15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。
3．冰冻切片时的注意事项：
①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。
②多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。
③放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。
④组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。
⑤当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。
⑥用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。
4．冰冻切片的快速染色法
冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色。以往，为了防止切片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹干后再固定。根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后镜下分辨不出核内的各种物质。冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来，经一年多来1000例冰冻切片的制作实践认为这样制作固定切片好，核染色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存。
方法：
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