茶多糖的制备工艺及质量控制
前 言
糖尿病（diabetes mellitus）是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症。因胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低，引起糖、蛋白、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱。临床以高血糖为主要标志，久病可引起多个系统损害。病情严惩或应激时可发生急性代谢紊乱如酮症酸中毒等。
糖尿病主要临床类型胰岛素依赖型糖尿病（IDDM,I）型可发生在任何年龄，但多发于青幼年。
临床特点是起病急，多食、多尿、多饮、体重减轻等症状较明显，有发生酮症酸中毒的倾向，必须依赖胰岛素治疗维持生命。起病初期血中胰岛细胞自身抗体阳性率高。口服葡萄糖胰岛释放试验可见基础胰岛素水平低于正常，葡萄糖刺激后胰岛素分泌曲线低平，显示胰岛素缺乏。
非胰岛素依赖型糖尿病（NIDDM，II型）也可发生在任何年龄，但多见于40岁以后中、老年。大多数病人起病缓慢，临床症状相对较轻。无酮症酸中毒倾向，但在一定诱因作用下，也可发生酮症酸中毒或高渗性昏迷。依赖胰岛素，但在饮食和口服降糖药治疗效果欠佳时，或因并发症和伴发病的存在，有时亦需要用胰岛素控制高血糖。胰岛细胞自身抗体阳性。空腹血浆胰岛素水平可正常、轻度降低或高于正常。胰岛素对葡萄糖刺激的反应可稍低、基本正常或高于正常，分泌高峰延迟。
随着世界经济的快速发展和人口的老龄化，糖尿病已成为肆虐全球的一种流行性非传染病，它与癌症、心血管疾病并称世界性三大疾病。全世界约有1.5亿糖尿病患者，预计到达2025年将突破3亿。目前已知降血糖药物成分中有萜类、肽、黄酮、糖类、胍类、硫醚、生物碱、香豆精和不饱和脂肪酸等化合物类型。
值得提出的是，在上世纪90年代后期开始，各种基因工程胰岛素类似物已广泛应用与临床。胰岛素类似物是经重组DNA技术合成、氨基酸序列与人胰岛素相异，但能与胰岛素受体结合，功能及作用与胰岛素相似的分子。快速作用胰岛素类似物，如
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美国礼来公司研制生产的单聚体胰岛素类似物优泌乐（Lyspro）;丹麦诺和诺德公司的诺和锐（Aspart）。长作用时间胰岛素类似物，目前只有法国安万特公司生产的甘精胰岛素（Glagrine）也已在国外广泛应用。多糖作为高等植物、动物细胞膜、微生物的细胞膜中的一类具有广泛生物活性的天然生物大分子，是生命有机体的重要构成成分，是维持生命必不可少的结构材料，某些特定结构的多糖有显著的降糖作用。 茶叶起源于中国，是在中国古代文献中最早被提及的天然药物之一。我国茶叶资源丰富，饮茶历史悠久，但是大量的粗老茶叶及制茶副产品未得到有效利用。 茶多糖(tea polysaccharide)是茶叶中继茶多酚之后发现的又一重要的生物活性物质。在中国民间早有用粗老茶叶治疗糖尿病的习俗。茶叶的保健功能与其所含的功能成分密切相关，茶多酚、茶色素、咖啡碱等生物活性成分已研究较多，而茶多糖的研究则相对较少。20 世纪80 年代起，随着国际上掀起的多糖生物学和生物技术研究热潮，国内外学者对茶叶所含的多糖类复合物进行了大量研究。发现茶多糖具有增加机体免疫能力、降血糖、降血脂、减少动脉粥样硬化、抗凝血、抗氧化、抗辐射等作用，具有很好的研究价值和经济价值。现已在以下几个方面得到开发和应用: 抗肿瘤药、治疗艾滋病等抗病毒药、延缓衰老药。另外茶多糖还有望用于保健食品的开发及糖尿病患者的辅助治疗。由于多糖的结构复杂, 进一步研究多糖的结构和功能任重而道远。茶多糖结构和活性功能的研究开发, 用粗老茶提取茶叶复合多糖再加以开发利用, 对促进茶叶产业的发展将起到重要的推动作用, 并且有重要和深远的意义。
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第一章 实验材料
1.1 材料
绿茶 产地浙江杭州
1.2 试剂
无水乙醇 AR 乙醚 AR 浓硫酸 AR 蒽酮 AR 葡萄糖 AR NaOH AR HCl AR 1.3 仪器
WS701型红外线快速干燥器722 光栅分光光 752 光栅分光光度计 循环水式真空泵 真空干燥箱 AL-104型电子天平 电热恒温水浴锅 R-201旋转蒸发器 超滤器
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第二章 茶多糖粗多糖样品的制备
2.1茶多糖粗多糖的提取 2.1.1文献记载的提取方法
常用的茶多糖提取的方法有两种： 1.水提法：
原料→水浸提(2～3次) →沉淀过滤→取滤液浓缩→乙醇沉淀→过滤、回收乙醇→粗多糖→精制、干燥、茶多糖。 2.醇提法：
原料→乙醇浸泡回流(3次) →取滤渣→沸水提取(3次) →过滤→提取液浓缩、脱脂、脱蛋白、脱色等→乙醇沉淀(2次) →取滤渣精制、干燥→茶多糖。
2.1.2本实验采用的工艺流程
粗老茶叶→打碎→水浸提→过滤→浓缩→乙醇沉淀→静置→离心→无水乙醇、乙醚交替洗涤→烘干→TPS 粗成品。
具体步骤：将茶叶打碎至粉末状，过筛（100目），加入五倍体积水以及0.3%纤维素酶，置于37℃水浴2h,期间不断搅拌。将提取液离心（8000rpm，15min），取上清保存。残渣加三倍体积水以及0.05%的胰蛋白酶，置于70℃水浴1h，期间不断搅拌。提取液离心（8000rpm，15min）取上清，将两次上清液合并，反复抽滤除杂质残渣。将提取液于60℃旋转蒸发浓缩至原体积的二分之一。加入三倍体积无水乙醇沉淀，离心分离沉淀。取少量无水乙醇、乙醚交替洗涤，真空干燥，得褐色粉末状茶多糖粗品。
2.2 茶多糖粗多糖样品的分析 2.2.1多糖含量测定
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硫酸—蒽酮法
测定原理：糖类与浓硫酸脱水成糠醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生颜色物质，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收，显色与多糖含量呈线性关系。 蒽酮试剂：取0.2g蒽酮溶于100ml浓硫酸中，当日使用有效。
标准葡萄糖溶液(100μg/ml)：精密称取100.8mg溶于1000ml容量瓶中，加水至刻度。 样品溶液（100μg/ml）：精密称取干燥恒重的样品100mg溶于蒸馏水中，定容至1000ml容量瓶。
分别取标准葡萄糖溶液0.1ml,0.2ml,0.3ml,0.4ml,0.5ml,加蒸馏水至1ml充分混合，取样品溶液1ml，分别加入4.0ml蒽酮试剂，冰浴10min，管口加塞，沸水浴中准确煮沸10min，再放入冰浴中迅速冷却，静置10min,620nm处比色测OD值。
表1 总糖含量测定方法
组别 葡萄糖标准液（ml） 蒸馏水（ml）
1 0 1
2 0.1 0.9
3 0.2 0.8
4 0.3 0.7
5 0.4 0.6
6 0.5 0.5
样品 1 0
置于冰浴5min
蒽酮（ml）
4
4
4
4
4
4
4
沸水浴准确反应10min
校正OD值（620nm） 0.087 0.155 0.205 0.268 0.324 0.385
0.267
2.2.2蛋白含量测定 Folin-酚法
Folin-酚试剂甲：将1g碳酸钠溶于50ml 0.1ml/L氢氧化钠溶液中，再把0.5g硫酸铜（CuS
:5
）溶于100ml 1%酒石酸钾溶液中，然后将前者50ml与后者1ml混合。混
合后当日使用有效。
Folin-酚试剂乙：上海世泽生物有限公司产品。
蛋白标准液(250μg/ml)：精密称取牛血清白蛋白250mg溶于蒸馏水中，定容于1000ml容量瓶中，低温保藏。
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