蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）技术手册
A 蛋白样本提取制备
蛋白样品制备是 Western Blotting的第一步，更是决定 WB成败的关键步骤， 总体原则和注意事项：
1：尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白 （通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）
2：保持蛋白的处于溶解状态（通过裂解液的PH 盐浓度 表面活性剂、还原剂等的选择）
3：提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等， （低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）
4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）
5：样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。
A-1 细胞或组织裂解 A-1-1 细胞裂解
裂解液 Lysis buffer 或商品化蛋白抽提试剂盒的选择* 目的蛋白分布定位 推荐裂解液 Lysis buffe 推荐试剂盒 全细胞 NP-40 or RIPA（附录1） 全蛋白抽提试剂盒
细胞质（可溶蛋白） Tris-HCl（附录1） 胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒 线粒体蛋白提取试剂盒
细胞质（细胞骨架等不溶蛋白） Tris-Triton（附录1） 蛋白分级抽提试剂盒 细胞质（磷酸化蛋白） 磷酸化蛋白抽提试剂盒 细胞膜 NP-40 or RIPA（附录1） 膜蛋白抽提试剂盒 蛋白分级抽提试剂盒
细胞核 RIPA（附录1） 核蛋白抽提试剂盒 线粒体 RIPA（附录1） 线粒体蛋白抽提试剂盒 亚细胞定位蛋白抽提试剂盒 细胞裂解操作方法：
1 培养的细胞经预冷的PBS 漂洗2 次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（种类与量见本节 2）
2 吸净PBS，加入预冷的裂解液， （(1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask; 0.5ml per 5x106
cells/60mm dish/75cm2 flask).
3 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，
4 4℃摇动30 min
5 4℃离心12,000 rpm，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力）
6 轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.
A-1-2 组织裂解
1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解， 2 将组织块放在圆底的微量离心管或 Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于 -80°C，
3 每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组
织样本量有适当比例， （最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).
4 4℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本， 弃沉淀,
A-2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂
推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL。
A-3 蛋白定量
Bradford 法 Lowry 法或BCA 法 （均有商品化试剂盒可选择，操作简单、需分光光度计或酶标仪），小牛血清白蛋白 (BSA) 作为标准曲线。如果裂解液中有NP40或其它表面活性剂，则推荐使用BCA 法。
A-4 电泳上样样品的准备 A-4-1 变性、还原蛋白样本
一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构（表位） ，因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要将蛋白样本进行变性，使之打开折叠的空间结构， 蛋白变性一般使用含阳离子变性去污剂如SDS的上样buffer （loading buffer），并于 95-100°C 煮沸 5 分钟，对于多次跨膜蛋白，可以于 70°C 加热 5-10 分钟，标准的上样buffer 称为2X Laemmli buffer， 上样时与样本！：！混合后变性上样即可： 2X Laemmli buffer 4% SDS
10% 2-mercaptoehtanol 20% glycerol
0.004% bromophenol blue 0.125 M Tris HCl
Check the pH and bring it to pH 6.8.
SDS 的阴离子环绕蛋白肽键使之带负电荷，蛋白分子量不同，结合的 SDS 数量不同，所带负电荷也不同，电泳迁移速度不同，因此 SDS-PAGE 电泳可将不同分子量的蛋白分离开。
A-4-2天然和非还原样本
某些抗体识别的表位是非连续氨基酸构成的蛋白三维结构，此种情况则需要进行非变性的WB，抗体的说明书一般会标注，这种非变性电泳不加 SDS，样本
也不需煮沸。
某些抗体仅识别蛋白的非还原态，如某些 cysteine 基的氧化态，因此 loading buffer 和电泳液中不加入 ?-mercaptoethanol and DTT
B 电泳
B-1 PAGE胶的制备
聚丙酰胺凝胶PAGE电泳根椐蛋白分子量进行分离蛋白，PAGE胶是由两种化合物聚合而成的，即丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis).，聚合需加入过硫酸铵及DMAP 或 TEMED，凝胶为中性、水溶性、三维网状结构。凝胶的孔径取决于总丙烯酰胺的百分含量（%T)）和交联度（%C） ，T%=(a+b)/m*100%; 和 C%=a/(a+b)*100%,其中: a=双体(bis)的重量 ;b=单体(arc)的重量 ;m=溶液的体积(ml) 。丙烯酰胺总量增加，则孔径减小，5%C构成最小的孔径，任何的 %C增加或降低，孔径都增加，凝胶的百分浓度组成需两个参数，丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis).的总量百分浓度（w/v） 。
B-2 蛋白分子量 Marker
预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪
B- 3 阳性对照
目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物， 用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性/特别是一抗的质量和效率。建议使用该对照。可查阅文献或抗体说明书选择购买或自提该对照样本。
B-4 内参对照
管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照。必须设立。B- 3 阳性对照目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物， 用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性，特别是一抗的质量和效率。
建议使用该对照。可查阅文献或抗体说明书选择购买或自提该对照样本。
B-5 上样与电泳
每孔上样量为 20-40 μg蛋白，使用专用枪头或注射针头，勿溢出加样孔， 标准电泳缓冲液：1X Tris-glycine： 25 mM Tris base 190 mM glycine 0.1% SDS 调 pH;8.3.
电泳时间按电流仪说明书推荐方法使用,(1 小时或过夜，取决于电压大小），当染料到达胶的底部，关电源
停止电泳，胶不能存放，应立刻进行下一步的转膜。
C 转膜与显色（Western Blot） C-1 胶中蛋白的检测
电泳后检测蛋白是否迁移正确与平均，可采用铜染或考马斯蓝染色检测，如果凝胶中的蛋白需要进行转
膜则需可逆的铜染法，否则采用不可逆考马斯蓝法染色。
铜染法：电泳胶用蒸馏水洗数秒钟，加入 0.3 M CuCl2染色5-10分钟，再用去离子水洗一次，在暗背景下观察在兰色胶背景下蛋白出现透明条带， 胶置于0.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0缓冲液中漂洗脱色两次，再置于电转缓冲液中开始转膜。
考马斯蓝法：用40%双蒸水, 10% 醋酸, 50%甲醇的溶液固定胶中蛋白，考马斯蓝R-250染液（凯基产品）室温染色4小时至过夜，保持摇匀，转入67.5%双蒸水, 7.5% 醋酸, 25%甲醇l摇匀至脱去多余的染料，蛋白被染成深蓝色。
C-2 蛋白转膜
蛋白因结合 SDS而带电荷，在电场下从胶中转至膜上，转膜操作根椐电转仪制
造商的说明书进行转膜方式分为半干和湿转两种，半干式转膜速度快，而湿式成功率高并特别适合用于分子量大于 100KD的蛋白。
湿式转膜三明治排列为：海绵/纸/胶/膜/纸/海绵，全部紧密排列，特别是胶/膜之间不能留有气泡，三明治安放的方向确认正确负极方为带负电的胶里的蛋白，向正极方（膜）电迁移。
标准的电转缓冲液为 1X Tris-glycine buffer 不含 SDS，但加入 20%甲醇，如果转膜的蛋白分子量大于80KD，则推荐加入 SDS使之终浓度为 0。1%。 半干式转膜中，三明治的排列为：/纸/胶/膜/纸，用电转缓冲液浸湿后，直接置于电转仪的正负极之间。胶于负极而膜置于正极。 半干式的电转缓冲液可不同于湿式的电转缓冲液， 推荐为： 48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲醇， 两类膜可供选择：硝酸纤维素膜和 PVDF 膜（正电荷尼龙膜），根据不同需要选择（下表），PVDF 膜需要浸泡甲醇中 1-2分钟，再孵育于冰冷的电转缓冲液中 5分钟，胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡 3-5 分钟，否则转膜时会导致条带变形。
注：大蛋白和小蛋白的转膜
电转移缓冲液中 SDS 与甲醇的平衡、蛋白的大小、胶的浓度都会影响转膜效果，如下调整可以增加转膜效率： 大蛋白（大于 100 KD）
1．对于大蛋白而言，其在凝胶电泳分离迁移较慢，而从凝胶转出也非常慢，因此对于这种大分子量蛋白。
应该用低浓度的凝胶，8%或更低，但因低浓度的胶非常易碎，所以操作时需十分小心。
2 大蛋白易在凝胶里形成聚集沉淀，因此；转膜时在电转移缓冲液加入终浓度为 0.1%的 SDS，以避免出现这种情况，甲醇易便 SDS从蛋白上脱失，因此应降低电转移缓冲液中甲醇的浓度至 10%或更低，以防止蛋白沉淀。
3 降低电转移缓冲液中甲醇的比例以促进凝胶的膨胀，易于大蛋白的转出。 4 如果使用硝酸纤维素膜，甲醇是必需的，但如果是 PVDF 膜，甲醇可以不必加入电转移缓冲液中，但转膜前 PVDF 需用甲醇活化。 5 选择湿式，4℃转膜过夜，以取代半干式转膜。
小蛋白（小于 100 KD
1 SDS妨碍蛋白与膜的结合，特别是对小蛋白更是如此，因此，对于小分子的蛋白，电转移缓冲液中可以不加 SDS。 2 保持 20%的甲醇浓度。
更多的转膜注意事项：
? 避免用直接接触膜，应使用镊子，手指上的油脂与蛋白会封闭转膜效率并易产生背景污斑
? 排列三明治时，尽量用移液器或 15ml 试管赶除胶与膜之间的气泡，或将三明治放在装有的培养皿中以 防止气泡产生，请戴手套！
? 确认裁剪的膜和滤纸与凝胶尺寸相同，否刚导致电流不能通过膜，从而转膜无效
? 鸡抗体易于与 PVDF 膜和其它尼龙膜结合，导致高背景，请替换成硝酸纤维素膜以降低背景。
C-3 膜上蛋白的检测：
丽春红 为检测转膜是否成功，可用丽春红染色， 2%的丽春红贮备液(20ML)：: 2%丽春红(0.4克)溶于 30%三氯乙酸(6克)和30%磺基水杨酸(6 克) 丽春红染色工作液：2%的丽春红贮备液 1：10稀释，即加 9 倍的 ddH2O
染色方法：
将膜放入 TBST 洗一次，再置于丽春红染色工作液中,在室温下摇动染色5 分钟， 大量的水洗膜直至水变清无色蛋白条带清晰， （膜也可以用 TBST 或水重新洗后再进行染色）PVDF 膜需用甲醇再活化后用 TBST洗后进行封闭。 10x TBS的配制 ： 24.23 g Trizma HCl 80.06 g NaCl 加约 800 ml 超纯水
用纯HCl调pH 至7.6 定容至 1 L. TBST的配制 ：
配制 1 L TBST：: 量取 100 ml 10x TBS + 900超纯水 + 1ml Tween20 Tween20 非常粘稠，用枪头不易吸取，请确定加入准确的量，最好用 Tris buffer.配成 10%的Tween20母液后使用。
C-4 膜的封闭
为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封闭， 传统上有两种封闭液：脱脂奶粉或BSA，脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白（因脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白） ，使用脱脂奶粉会结合磷酸化抗体从而易产生高背景。 某些抗体用 BSA 封闭时因不明原因可能会产生比脱脂奶粉更强的信号，请仔细阅读说明书注明的注意事项和膜的特殊的封闭方法。
配制 5%脱脂奶粉或 BSA 溶液：每100 ml TBST 中加入 5 g脱脂奶粉或 BSA，混匀后过滤，如不过滤会导致使膜污染上细微黑颗粒。 封闭时，4°C摇动，封闭 1 hour ，再用 TBST 洗5秒，进入下一步抗体的孵育。
C-5 一抗的孵育
孵育Buffer：按抗体说明书建议的稀释倍数，用TBST 稀释一抗，如果说明书没有建议的稀释倍数，则参照一般推荐的稀释倍数(1:100-1:3000)，一抗浓度过高会导致产生非特异性条带。
某些实验室传统上在封闭液中孵育抗体，而有些实验室用不含封闭剂的TBST 来孵育抗体，结果因抗体而异，有时两者结果相同，有时结果不同。
注：如果不存在高背景的问题，某些抗体用含低浓度(0.5 – 0.25%) 脱脂奶粉或 BSA 的封闭液来,稀释，可产生相对更强的信号条带。
孵育时间：一抗的孵育时间可从几小时至过夜（一般不超过 18 小时）不等，取决于抗体与蛋白的亲和性和
蛋白的含量丰度，建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性
结合。
孵育温度：尽可能低温孵育，如果在封闭液中孵育一抗过夜，应在4°C 进行否则会产生污染而破坏蛋白（降别是磷酸基团）。 孵育一抗时需保持适当的摇动使之均匀覆没膜，防止结合不均匀。
C-6 二抗的孵育
一抗孵育结束后，用 TBST 摇动洗膜数次，每次 5min 或更长，去除残留的一抗。 孵育 Buffer和稀释倍数：用TBST 按说明书推荐的倍数稀释二抗，如果说明书没有标出稀释倍数，则按常规的倍数稀释(1:1000- 1:20,000)预试，二抗的浓度过高也会导致非特异性条带。亦可以在封闭液中孵育二抗（和一抗） ，但可能在降低背景同时导致特异性条带的信号也减弱，可能是封闭剂阻碍了抗体与靶蛋白的结合。
孵育时间和温度：室温、1-2 hours, 摇动
二抗连接物：推荐使用二抗连接HRP，不建议连接AP 碱性磷酸酶，因其不够灵敏。 C-7显色
显色分为酶促底物发光和化学发光法或荧光法 酶促底物发光法代表为 DAB显色法
附录 1 WB 实验试剂配方 1 Nonidet-P40 (NP40) buffer 150 mM sodium chloride 1.0% NP-40 (或Triton X-100 ) 50 mM Tris, pH 8.0
2 RIPA buffer (Radio Immuno Precipitation Assay buffer) 150 mM sodium chloride 1.0% NP-40 or Triton X-100 0.5% sodium deoxycholate
0.1% SDS (sodium dodecyl sulphate) 50 mM Tris, pH 8.0
注：The 10% sodium deoxycholate stock solution (5 g into 50 ml) must be protected from light.
3 Tris-HCl buffer 20 mM Tris-HCl, pH 7.5
4 Tris-Triton buffer 10 mM Tris, pH 7.4 100 mM NaCl 1 mM EDTA 1 mM EGTA 1% Triton X-100 10% glycerol 0.1% SDS 0.5% deoxycholate
All four of these buffers will keep at 4°C for several weeks or for up to a year aliquotted and stored at -20°C.
5 TBS 10x (concentrated TBS) 24.23 g Trizma HCl 80.06 g NaCl
Mix in 800 ml ultra pure water. pH to 7.6 with pure HCl. Top up to 1 L. TBST
For 1 L: 100 ml of TBS 10x + 900 ml ultra pure water + 1ml Tween20
6 PBS: 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4 g NaCl (500 ml distilled
water)pH 7.4
附录 2 SDS-PAGE 胶的配制 一 30% (W/V) Acrylamide 的配制
1称量 Acrylamide290g，Bis10 g 下列试剂，置于 1 L烧杯中 2 向烧杯中加入约 600 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 加去离子水将溶液定容至 1 L，用 0.45 ?μm 滤膜滤去杂质。 4. 于棕色瓶中 4℃保存。
注意：丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴
手套等。聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成份。 二 配制浓缩胶缓冲液： 1.0mol/L TrisHCl Ph6.8, 4℃保存 三 配制分离胶缓冲液： 1.5mol/L TrisHCl Ph8.8, 4℃保存 四 配制 10%SDS（W/V） ：
五 配制 10% W/V）过硫酸铵（AP） ：称1 克过硫酸铵，加10mL 去离子水搅拌溶解，贮存于4℃。 （注意10%过
硫酸铵溶液在 4℃保存可使用2 周左右，超过期限会失去催化作用。 六 TEMED 原溶液
七 电泳缓冲液（5×） ：Tris 15g+甘氨酸 72g+SDS 5g+H2O 至 1L,临用时稀释 5 倍至 1×SDS 电泳缓冲液加入 电泳槽中。
八 配制 1 M Tris-HCl的方法 1. 称量 121.1 g Tris置于1 L 烧杯中。
2. 加入约 800 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 加入浓盐酸调节所需要的 pH 值。 4 将溶液定容至 1 L。 5. 高温高压灭菌后，室温保存。
注意：应使溶液冷却至室温后再调定 pH值，因为 Tris溶液的pH 值随温度的变化差异很大，温度每升高 1℃，溶液的pH 值大约降低 0.03 个单位。
water)pH 7.4
附录 2 SDS-PAGE 胶的配制 一 30% (W/V) Acrylamide 的配制
1称量 Acrylamide290g，Bis10 g 下列试剂，置于 1 L烧杯中 2 向烧杯中加入约 600 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 加去离子水将溶液定容至 1 L，用 0.45 ?μm 滤膜滤去杂质。 4. 于棕色瓶中 4℃保存。
注意：丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴
手套等。聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成份。 二 配制浓缩胶缓冲液： 1.0mol/L TrisHCl Ph6.8, 4℃保存 三 配制分离胶缓冲液： 1.5mol/L TrisHCl Ph8.8, 4℃保存 四 配制 10%SDS（W/V） ：
五 配制 10% W/V）过硫酸铵（AP） ：称1 克过硫酸铵，加10mL 去离子水搅拌溶解，贮存于4℃。 （注意10%过
硫酸铵溶液在 4℃保存可使用2 周左右，超过期限会失去催化作用。 六 TEMED 原溶液
七 电泳缓冲液（5×） ：Tris 15g+甘氨酸 72g+SDS 5g+H2O 至 1L,临用时稀释 5 倍至 1×SDS 电泳缓冲液加入 电泳槽中。
八 配制 1 M Tris-HCl的方法 1. 称量 121.1 g Tris置于1 L 烧杯中。
2. 加入约 800 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 加入浓盐酸调节所需要的 pH 值。 4 将溶液定容至 1 L。 5. 高温高压灭菌后，室温保存。
注意：应使溶液冷却至室温后再调定 pH值，因为 Tris溶液的pH 值随温度的变化差异很大，温度每升高 1℃，溶液的pH 值大约降低 0.03 个单位。