分析检验方案设计与实施综合报告
题目： 凯氏定氮法测大豆中总氮
含量的实验条件分析
姓 名： 孟照明
学 号： 20号 专业班级： 分析3126班 指导教师： 姜老师 王老师
分析检验方案设计与实施
凯氏定氮法测大豆中总氮含量的实验
条件分析
摘 要
将蛋白质样品在硫酸铜的催化下，用氧化性试剂消化分解转化为铵离子，然后将含有铵试液置于蒸馏瓶中，加高浓度碱使铵离子转化为氨，然后与硫酸结合生成硫酸铵，再加热蒸馏，用过是的标准硼酸溶液吸收氨气，再用盐酸标准溶液滴定H2B03，以甲基红作为指示剂，测出含氮量，将结果乘以换算系数，计算出粗蛋白质含量。
关键词：凯氏定氮仪;消化时间;蒸馏;滴定。
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分析检验方案设计与实施
目 录
摘 要 .................................................. 错误！未定义书签。 第1章 前言 .............................................................. 3
1.1 本课题的来源、目的及意义 .......................................... 3
1.2 课题背景及国内外研究现状 ......................................... 3 第2章 实验部分 .......................................................... 4
2.1 实验原理 ......................................................... 4 2.2
实验药品与仪器 .................................................... 4
2.3 实验内容 .......................................................... 5
2.3.1 0.1mol／L盐酸标准溶液的配制与标定 ............................. 5 2.3.2 样品消化 ....................................................... 5 2.3.3 滴定 ........................................................... 5 第3章 结果与分析 ........................................................ 6 3.1国家标准测定结果 ................................................. 6 3.2实验最佳条件确定及过程分析 ....................................... 7 第4章 结论 ............................................................. 8 致谢 ............................................................. 9 参考文献 ......................................................... 9
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第一章 前言
蛋白质在生物体内占有特殊的地位，它和核酸是构成原生质的主要成分，是生命现象的物质基础。食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源。具有糖类和脂肪不可替代的作用。作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用。蛋白质的分离与定性、定量分析是生物化学和其他生物学科、食品检验、临床检验、疾病诊断、生物药物分离提纯和质量检验中最重要的工作。蛋白质是由a一氨基酸以酰胺键(肽键)相结合形成的结构极其复杂的高分子化合物，是生物体中的主要含氮物质。蛋白质与细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质转运和遗传等密切相关，蛋白质测定方法一般可分为间接方法和直接方法。间接方法是通过测定样品中蛋白质的含氮量进行推算蛋白质含量的方法。直接方法则是根据蛋白质的物理和化学性质，直接测定蛋白质含量的方法。蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，与生命的起源和进化都密切相关，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其含量的测定在生化分析和临床分析中具有重要意义，研究和开发新的、高灵敏度的蛋白质测定方法是生物化学研究的一个活跃领域。测定蛋白质的方法不断发展，主要有凯氏定氮法(国际经典测定方法)、分光光度法、电化学法、滴定法、高压液相色谱法、电泳法、免疫法等。了解各种蛋白质测定方法的原理和技术特点，对在实际工作中选择适宜的分析方法具有重要的指导意义。
蛋白质是食品检验中经常进行检测的项目。测定食品中蛋白质的含量，了解食品的质量，为合理配膳提供数据，保证不同人群对蛋白质的需要，掌握食品的营养价值和品质的变化，以达到合理利用食品资源。近年来，人们发展了许多测定蛋白质的方法，如双缩脲法、分光光度法、凯氏定氮法、紫外吸收法、染料结合法、质谱分析法等，质谱分析是测定结果最准确的测定方法；凯氏定氮法适用范围最广泛，分光光度法是最为简便快速的测定方法，但就方法的准确性、精密度以及应用程度而言，国际经典测定方法一凯氏定氮法为首选 ，该法也是相关专业学生必须掌握的经典试验方法之一。现在尽管有很多先进的自动或半自动凯氏定氮仪，但这些仪器不仅价格昂贵，且需专门试剂，目前尚难普及，而对大
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批量的学生试验更不适合，所以凯氏定氮法适用范围是目前分析含氮化合物最常 用的方法。
第二章 实验部分
2.1 实验原理
利用硫酸及催化剂与样品加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成CO2 和H2O逸出，而蛋白质中的氮则转化成(NH4)2SO4，在强碱条件下加热蒸馏，其中NH3被硼酸吸收为(NH4)2B4O7，然后用标准的盐酸溶液滴定，根据盐酸的消耗量和浓度计算出氮的含量，乘以蛋白质系数，即为蛋白质含量。
反应式如下：
2CH3 —CH一C00H+13H2SO4= (NH4)2SO4+6CO2↑+12SOz↑+16H2O |
NH2 (NH4)2SO4+2NaOH=2NH3↑+NazSO4+2H20
2NH3 +4H3BO3 = (NH4)2B4O7+5H2O (NH4)zB4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3
根据原理测定过程可分为消化、蒸馏吸收、滴定三个过程。 2.2 实验仪器与试剂
2.2.1 实验仪器
? 凯氏定氮仪 一台 ? 分析天平 一台 ? 酸性滴定管 一个 ? 微量滴定管 一个 ? 锥形瓶 7个 ? 消化装置 一台 ? 容量瓶 1个
2.2.2 实验试剂
? 硫酸铜（CuSO4·5H20） ? 硫酸钾
? 硫酸（密度为1.8419g/L） ? 硼酸溶液（20g/L）
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? 氢氧化钠溶液（400g/L） ? 0.1mol/L盐酸标准滴定溶液。
? 混合指示试剂：0.1%甲基红乙溶液液1份，与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。
? 黄豆粉。
2.3 实验内容
2.3.1 0.1mol／L盐酸标准溶液的配制与标定
配制：取盐酸9.0ml，加水适量使成1000ml，摇匀，待标定。
标定： 取在270℃～300℃干燥至恒重的基准无水碳酸钠约0.15g，精密称定，加水50ml使溶解，加甲基红-溴甲酚绿混合指示液10滴，用本液滴定至溶液由绿色转变为紫红色时，煮沸2分钟，冷却至室温，继续滴定至溶液由绿色变为暗紫色。每1ml的盐酸滴定液（0.1mol／L）相当于5.30mg的无水碳酸钠，根据本液的消耗量与无水碳酸钠的取用量，算出本液的浓度，即得。
滴定至近终点需煮沸2分钟，是因为此时溶液中有大量H2CO3，和NaHC03，形成缓冲对，使终点不敏锐。若加热煮沸可使H2C03分解为C02和H20而除去。
2.3.2 样品消化
称取黄豆粉约0.2g（±0.001g），移入干燥凯氏烧瓶中，加入0.5g硫酸铜和10g硫酸钾，加入10mL浓硫酸，放在通风橱中加热消化，开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热0.5h，取下放冷，即为消化液。
试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，即得试剂空白消化液。 2.3.3 滴定
将上述吸收液用0.1mol／L盐酸标准溶液直接滴定至由蓝色变为微红色即为终点，记录盐酸溶液用量，同时做空白实验，记录消耗体积。
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第三章 数据记录与分析 3.1国家标准测定结果
表3-1 0.1mol／L盐酸标准溶液的配制与标定数据记录 测定项目 m(称样前NaOH)/g m(称样后NaOH)/g m(NaOH)/g V(消耗体积)/mL V0/mL C(HCl)/mol/L 平均C(HCl)/mol/L 相对极差/% 0.10481 0.10484 0.1048 0.06 表3-2 大豆粉总氮含量测定数据记录 1 2 3 0.2006 0.2007 0.2004 9.220 9.218 9.219 38.10 38.14 38.13 0.2007 0.2006 0.2004 9.221 9.220 9.218 38.10 38.12 38.14 0.100 38.12 0.04 1 24.3744 24.2433 0.1501 27.02 2 表3-1 24.2433 24.0741 0.1502 27.03 0.00 0.10481 0.10487 3 24.0741 23.9240 0.1501 27.02 4 23.9240 23.7737 1.1503 27.04 测定项目 m(NaOH)/g V(消耗体积)/mL ｗ/% m(NaOH)/g V(消耗体积)/mL ｗ/% V0/mL 平均ｗ/% 相对平均偏差/% 4 0.2005 9.221 38.10 0.2006 9.220 38.12
分析：这组数据是按照国家标准操作完成的，消化时间为90min。根据其数据与下面条件实验做对比， 对浓硫酸、称样量、碱用量进行实验探究，选择出它们的最佳用量，使消化时间大大降低，所测含量准确，提高了凯氏定氮的速度和精确度。
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3.2实验最佳条件确定及过程分析
表3-3 大豆粉总氮含量测定数据记录（改变称样量） 测定项目 m（试样）/g V(消耗体积)/mL m（试样）/g V(消耗体积)/mL V0/mL 平均ｗ/% 消化时间/min 相对平均偏差/% 37.72 90|90 0.08 37.79 140|140 0.19 1 0.2033 9.240 0.203 9.241 2 0.4012 19.200 0.4021 18.212 0.100 38.14 150|150 0.04 38.32 180|180 0.00 3 0.603 27.420 0.6025 27.418 4 0.801 36.620 0.8012 36.621 分析：在不同称样量时，按国家标准进行消化，根据数据分析可得，称样量的多少影响消化时间，为了节省时间，节约实验成本，最佳称样量为:0.2000 g.
表3-4 大豆粉总氮含量测定数据记录（改变硫酸用量） 测定项目 1 2 3 4 m（试样）/g 0.2010 0.2011 0.2012 0.2014 V(消耗体积)/mL V(加入硫酸体积)/mL m（试样）/g V(消耗体积)/mL V(加入硫酸体积)/mL 9.228 8 0.2009 9.225 8 9.230 10 0.2010 9.266 10 9.24 15 0.2012 9.238 15 — 20 0.2014 — 20 ｗ/% 38.07|38.07 38.06|38.06 38.08|38.08 — 平均ｗ/% 38.07 38.06 38.08 — 消化时间/min 120 90 100 80 相对平均偏差0.04 0.00 0.00 — /% 分析：样品在消化时加入浓硫酸的量必须过量，一是脱水作用，将样品中有机物脱水然后碳化成c；二是氧化作用，浓硫酸和硫酸钾、硫酸铜一同加热使温度达到400℃ 以上，碳还原硫酸生成SO3，而碳本身被氧化成CO2；三是分解作用，将蛋白质分解，SO2还原N生成NH4ˉ ，本身被氧化成SO3；四是吸收作用，生成的NH4ˉ 与浓硫酸反应生成(NH4)2SO4 ；五是生成的(NH4)2SO4保存在浓硫酸溶液中不至于损失 。所以，在样品为0.2000g时，硫酸加入量为10ml。这样可以使消化时间大大降低，提高了凯氏定氮的速度。
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分析检验方案设计与实施
表3-5 大豆粉总氮含量测定数据记录（改变碱用量) 测定项目 m（试样）/g V(NaOH)/mL V(消耗体积)/mL ｗ/% 平均ｗ/% 相对平均偏差/% 1 0.2004 40.00|40.00 7.250|7.251 30.33|30.33 30.33 0.00 2 0.2007 60.00|60.00 9.216|9.218 38.49|38.50 38.5 0.01 3 0.2003 80.00|80.00 9.205|9.207 38.52|38.54 38.53 0.03 4 0.2008 100.00|100.00 9.220|9.221 38.49|38.50 38.5 0.01
分析：蒸馏时必须加碱(可加入NaOH)，加入碱的作用一是中和硫酸，二是使溶液处于强碱性，这样才能使(NH4)2SO4变成NH3被蒸馏吸收。碱的用量取决于消化时硫酸的用量和碱的浓度，根据实验数据显示，碱用量为60ml。
第四章 结论
经典的凯氏定氮法试样消化阶段必须有定氮催化剂与硫酸(比重1．84，无氮)参与，催化剂一般用CuSO·5H2O、K2SO 。但由于CuSO4·5H O、K2SO4 和浓H2SO4 的用量不合适，一方面导致消化时间过长，降低了分析化验人员的工作效率，使教学试验不能在规定的时间内完成凯氏定氮的整个过程。另一方面，过量的催化剂与硫酸造成资源浪费及环境污染。在研究经典的凯氏定氮法中，许多人只注重CuSO·5H O和K2SO4用量,而忽略浓硫酸、称样量及碱用量对消化时间的影响。本研究对经典的凯氏定氮法进行了研究， 对浓硫酸、称样量及碱的用量做了探究实验，选择出它们的最佳用量，使消化时间大大降低，提高了凯氏定氮的速度。试验证明，该最佳条件对蛋白质含量高的样品还是蛋白质含量低的样品都能完成消化，这样不仅能使学生课堂试验能在规定的时间内完成，也适合批量样品中蛋白质含量的消化测定，有一定的应用价值。同时也提高分析化验人员的工作效率和学生教学试验及环境保护都有很大的益处。
由试验结果看出，各因素对消化时间的影响是有差异的。以最佳条件作验证试验，消化时间仅为90 min。
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致谢
本实验在姜老师、王老师的悉心指导和严格要求下得以完成，从课题选择到具体的写作过程，论文初稿与定稿无不凝聚着姜老师、王老师的心血和汗水，在我的实验期间，姜老师、王老师为我提供了许多专业知识上的指导和一些富于创造性的建议，姜老师、王老师一丝不苟的作风，严谨求实的态度使我深受感动，没有这样的帮助关怀和熏陶，我不会这么顺利的完成实验。在此向姜老师、王老师老师表示深深的感谢和崇高的敬意！
我还要感谢同小组的人员谢谢你们的帮助和支持，同时，在设计写作过程中，我还参考了有关的书籍和论文，在这里一并向有关的作者表示谢意。
参考文献
张玉廷 张彩华主编.农产品检验技术.北京：化学工业出版社，2009.7 GB/T 5511-2008 谷物和豆类 氮含量测定和粗蛋白质含量测定 凯氏法 GB/T 5009.5-1985 食品中蛋白质的测定方法
GB/T 5009.5-2003 蛋白质测定的国家规定方法：凯氏定氮法
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致谢
本实验在姜老师、王老师的悉心指导和严格要求下得以完成，从课题选择到具体的写作过程，论文初稿与定稿无不凝聚着姜老师、王老师的心血和汗水，在我的实验期间，姜老师、王老师为我提供了许多专业知识上的指导和一些富于创造性的建议，姜老师、王老师一丝不苟的作风，严谨求实的态度使我深受感动，没有这样的帮助关怀和熏陶，我不会这么顺利的完成实验。在此向姜老师、王老师老师表示深深的感谢和崇高的敬意！
我还要感谢同小组的人员谢谢你们的帮助和支持，同时，在设计写作过程中，我还参考了有关的书籍和论文，在这里一并向有关的作者表示谢意。
参考文献
张玉廷 张彩华主编.农产品检验技术.北京：化学工业出版社，2009.7 GB/T 5511-2008 谷物和豆类 氮含量测定和粗蛋白质含量测定 凯氏法 GB/T 5009.5-1985 食品中蛋白质的测定方法
GB/T 5009.5-2003 蛋白质测定的国家规定方法：凯氏定氮法
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