球菌 （葡萄球菌, 链球菌）
杆菌（大肠杆菌） 弧菌（霍乱弧菌）
细菌染色法:革兰氏染色 （葡萄球菌、大肠杆菌）
3.细菌的基本形态观察球菌（葡萄球菌）球菌（链球菌）
弧菌（霍乱弧菌）杆菌（大肠杆菌）
革兰染色
1. 制片 2. 初染 3. 媒染 4. 脱色 5. 复染 6. 镜检 Notes:
乙醇脱色时间是关键环节:
脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌； 脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。 脱色时间一般为3-5s左右。
注意：使用完酒精灯后，请随时将酒精灯火焰扑灭！！Gram stain 革兰染色葡萄球菌方法：干燥、固定标本初染（结晶紫1-3分钟）流水冲洗流水冲洗大肠杆菌媒染（卢戈氏碘液30—60秒脱色（95%酒精流水冲洗3—5秒）复染（沙黄90秒）流水冲洗油镜镜检革兰染色原理 1细胞壁结构 G+：细胞壁结构致密，肽聚糖层厚，脂质含量少 阳性positive（紫兰色）阴性negative（红色）作业：（绘图）1.球菌（葡萄球菌,链球菌）杆菌（大肠杆菌）弧菌（霍乱弧菌）2.记录革兰染色的实验原理和步骤 G-：细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖等含有大量的脂质 2. 等电点
3. 细胞内含核糖核酸镁盐
细菌形态观察：肉毒梭菌 (革兰氏染色)、 产气荚膜
梭菌(荚膜染色)、淋球菌(革兰氏染色)、 白喉杆(奈瑟氏染色） 物理消毒与灭菌：紫外线对细菌的作用
细菌耐药性检测与机制探讨 细菌对抗生素敏感性试验 致病性球菌的分离培养与鉴定（2） 抗“O”试验 肠道菌的分离与鉴定：双糖铁培养基接种及初步鉴定
1.Check morphology of bacteria Glass Slide Demonstration示教玻片肉毒梭菌（革兰氏染色）油镜下观察：为G+粗短杆菌，芽胞椭圆形，大于菌体，位于次极端，使菌体呈网球拍状。淋球菌（革兰氏染色）油镜下观察：肾形或豆形G-双球菌，两菌的接触面较平坦或略向内陷。
细菌染色法2——奈瑟氏染色（白喉杆菌的异染颗粒）【方法】1、细菌涂片、干燥和固定。2、临用时将第一液10ml与第二液5ml相混合，将此混合液加入已固定的细菌涂片上，染1~2分钟，水洗；3、以第三液复染30秒~1分钟，水洗，待干；4、油镜镜检。【结果】菌体呈黄褐色，极体呈兰紫色。
紫外线对细菌的作用
产气荚膜梭菌（荚膜染色）油镜下观察：为G+粗大杆菌，菌体稍短，两端钝圆，单个或成双存在，外围有一圈透明荚膜。白喉杆菌:
原理
紫外线使DNA链上相邻的两个胸腺嘧啶以共价键结合形成二聚体，干扰DNA的复制及转录，导致细菌的变异或死亡。紫外线的穿透力低
细菌对抗生素敏感性试验 结果
无抑菌圈——不敏感 抑菌圈为10mm——低度敏感 抑菌圈为10-20mm——中度敏感 抑菌圈>20mm——高度敏感 实验结果实验结果 4、细菌的血清学实验2 抗“O”试验血凝板孔号病人血清1:400磷酸盐缓冲液（PH6.5）还原溶血素“O”2%兔红细胞悬液个人操作30.10.10.1原理：?A族乙型链球菌产生的溶血素“O”，在还原状态下有溶血作用。它是溶血性链球菌的代谢产物之一，是一种含-SH基的蛋白质，能溶解红细胞，溶血素“O”的溶血力不稳定，易因氧化而失去活力，在还原剂的作用下可以使其重新激活而恢复其溶血力。?溶血素“O”具有很强的抗原性，能和血清内相应的抗体结合，人受溶血性链球菌感染后2—3周就能产生抗体，即抗链球菌溶血素“O”抗体。此种能中和溶血素“O”的抗体，直到病愈后数月至余年才消失。?因此，当血清内这种抗体效价显著增高时，表示机体近期曾受溶血性链球菌感染或反复溶血性链球菌侵害，比如风湿热，急性肾小球炎等。1 0.2___0.120.150.050.1摇匀后放37℃水浴箱15分钟0.10.10.1摇匀后放37℃水浴箱45分钟抗体单位4000533800 双糖铁培养基原理：不同的肠道细菌对同一种糖的分解能力不同，非致病性的肠道杆菌能分解乳糖及葡萄糖；致病性的肠道杆菌不能分解乳糖。根据这一特点，将葡萄糖和乳糖按一定的比例（1：10）配制成双糖培养基，并在培养基中加入1%酚红酒精溶液。将肠道细菌接种至该培养基中，根据培养后结果初步鉴定肠道致病菌与非致病菌。作业：1、绘图：肉毒杆菌(革兰氏染色)、产气荚膜杆菌（荚膜染色）、淋球菌(革兰氏染色)、白喉杆菌（奈瑟氏染色）2、紫外线对细菌的作用3.记录实验结果：细菌对抗生素敏感性试验、双糖铁试验4.记录抗O实验结果和诊断葡萄糖：乳糖1:10 1%酚红酒精 A：非致病菌B：致病菌
Capsule荚膜（Streptococcus pneumoniae肺炎球菌） Flagellum鞭毛（Salmonella typhi伤寒沙门菌） Spore芽胞（Clostridium tetani破伤风梭菌） Pilus菌毛
4.Widal test肥达试验 肠道菌SS平板划线分离
Capsule荚膜（Streptococcuspneumoniae肺炎球菌）Pilus菌毛金黄色葡萄球菌Staphpylococcus aureuson blood agar plates1:10病人血1-8各加生理盐水200微升清200微升200微升生理盐水对照12345678第医二学1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280次微1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560弃去200微升实生验物I伤寒杆菌的O抗原学II伤寒杆菌的H抗原各200微升轻轻摇匀III甲型副伤寒杆菌的H抗原IV乙型副伤寒杆菌的H抗原37度，45-60分钟 双毛菌
Flagellum鞭毛（Salmonellatyphi伤寒沙门菌）Spore芽胞（Clostridiumtetani破伤风梭菌）表皮葡萄球菌Staphylococcusepidermidison blood agar plates
肥达试验
试验步骤：1、取清洁的血凝板两块，两块血凝板分别取16孔，分成4组，每8孔为一组，在32孔中均加入生理盐水200微升。2、在每一组的第一孔中加入病人血清200微升，混匀；3、对倍稀释：用微量移液器吸200微升液体到第二孔对倍稀释，依次对倍稀释至第七孔，再从第七孔中移走200微升混合液体仍到废物缸中，第八孔对照。4、在第一组的8孔中加入伤寒杆菌的O抗原200微升，用相同的办法分别在第二组、第三组、第四组的液体中加入伤寒H抗原以及副伤寒甲、已的H抗原；5、加完抗原后，轻轻摇匀血凝板，将其放入45度的温箱中约45分钟。6、取出血凝板，观察结果，记录凝集价，并做出判断作业：（绘图）Capsule荚膜（Streptococcus pneumoniae肺炎球菌）Flagellum鞭毛（Salmonella typhi伤寒沙门菌）Spore芽胞（Clostridium tetani破伤风梭菌）记录肠道菌SS平板划线分离的实验原理和步骤记录肥达试验的实验原理和步骤
Treponema (Fontana镀银染色法)梅毒螺旋体
Leptospira (Fontana镀银染色法)钩端螺旋体 记录肠道菌分离与鉴定的过程，并分析试验结果
(1)Inoculation of Semi-solid Agar Medium半固体培养基的接种
(2)Biochemical reactions生化反应（sugar fermentations糖发酵、IMViC、Hydrogen sulfide 硫化氢(H2S)、Urease尿素酶）
MacConkey test麦康凯实验 (R因子的传递
1.Morphologyof bacteria细菌形态观察Treponema pallidum梅毒螺旋体Treponema pallidum梅毒螺旋体
Leptospira钩端螺旋体Leptospira钩端螺旋体
五糖发酵管BA葡乳麦甘蔗肠道细菌的动力学检查半固体培养基的接种
穿刺接种法：接种针 半固体培养基 试验菌（大肠杆菌、痢疾杆菌） 目的：动力检查，是否有鞭毛
sugar fermentations糖发酵sugar fermentations糖发酵当细菌分解某种糖类时，能够产酸（+），使pH指示剂（溴甲酚紫）变成黄色，有些不但能产酸还能产气（），使糖发酵管中的小倒管充有气泡；有些指示剂保持原来的紫色（—）。阴性产酸产气产酸不产气—+The IndoleTest 吲哚（靛基质）试验The Methyl RedTest甲基红试验The indoletest examines the ability of a bacteria to breakdown the amino acid trytophan色氨酸.The presence ofindoleis confirmed by the addition of a few drops of Kovac'sIndolereagent二甲基氨基苯甲醛.The red layer at the top indicates a positive test.在培养基中加入二甲基氨基苯甲醛（靛基质试剂），能和靛基质结合，形成红色化合物（玫瑰吲哚）The Methyl Red Test examines a bacteria ability to ferment glucoseto produce \Such bacteria are known as mixed acid fermentors发酵罐because they lower the pH of the medium to below 4.8, the point at which the indicator methyl redis truly red.The VogesProskauerTest VP试验The Methyl RedTest,The VogesProskauerTest原理：葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇混合酸(甲酸、乙酸)KOH+空气氧化二乙酰pH<4.5 ?-奈酚+蛋白胨水起催化作用中的精氨酸甲基红指示剂所含有的胍基红色化合物红色（VP试验阳性）(甲基红试验阳性)In the butylene-glycol丁烯-乙二醇fermentation pathway, glucoseis converted to acetylmethylcarbinol乙酰甲基甲醇(AMC) and finally to butyleneglycol.The addition of alphnaphtholα-萘酚and potassium 方法：结果：红色为阳性应用：肠杆菌科细菌的鉴定hydroxide氢氧化钾tests for the presence of AMC.The red tube on the right is positive.The CitrateUtilization Test 枸橼酸钠利用试验当某些细菌利枸橼酸盐作为唯一碳源时，可以在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，并分解铵盐生成氨，使培养基由酸性变成碱性，如果预先在培养基中加入溴酚兰，则培养基由绿色变成深兰色。使指示剂变色.大肠杆菌不能利用枸橼酸盐，在该培养基上不能生长，为枸橼酸盐试验阴性，The UreaseTest 尿素酶试验某些细菌具有尿素酶，能分解形成大量的氨，使培养基酸碱度上升呈碱性，酚红指示剂呈红色，为阳性。作业：（绘图）Treponema(Fontana镀银染色法)梅毒螺旋体Leptospira(Fontana镀银染色法)钩端螺旋体记录肠道菌分离与鉴定的过程，并分析试验结果The Hydrogen Sulfide Test 硫化氢试验(H2S)某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，生成硫化氢，而培养基中含有铅盐或铁盐，形成黑褐色的硫化铅或硫化铁沉淀。
Recordprocedure of isolation and identification of enteric bacilli, and analysethe results记录肠道菌分离与鉴定的过程，并分析试验结果肠道杆菌的分离与鉴定步骤粪便（或肛拭）增菌培养基SS琼脂平板或其他肠道选择培养基动力检查、IMViC、双糖铁培养基、血清反应等生化反应4.Conjugation of bacteria carrying a unique plasmid细菌质粒的接合Result Demonstration结果示教：MacConkeytest麦康凯实验(R因子的传递，transfer of R factor)培养基：MacConkeyAgar（含氯霉素）供体菌：鼠伤寒沙门菌氯霉素耐药株（无色菌落）受体菌：大肠杆菌氯霉素敏感株变异菌：大肠杆菌氯霉素耐药株（红色菌落）耐药性质粒resistant plasmidMacConkeyAgar, aSelective and Differential Medium
实验方法：抗酸染色（Acid Fast Stain）分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，通过加热和延长染色时间来促使其着色。当分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为兰色。1、细菌涂片标本的制备(和革兰氏染色相同)涂片2、染色1）初染：滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用流水冲洗。2）脱色：3%盐酸酒精脱色30秒~60秒，用流水冲洗。3）复染：用碱性美兰溶液复染1分钟，用流水冲洗后用吸水纸吸干。干燥固定
? 齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。
当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为兰色。
3、油镜观察结核杆菌染成红色其他为蓝色实验结果初染脱色复染镜检未染色初染后脱色后复染后
结核杆菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝状生长。 背景及非抗酸性细菌呈兰色。