卫生微生物学实习指导
实验方法
对A，B两株细菌进行质粒分型
1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落（A，B），并分别接种于5ml LB（含Amp100μg/ml）液体培养基中，37℃、180rmp振荡培养过夜（约12-14hr）。
2. 取1.5ml培养液于1.5ml EP管中，12000rmp离心1min。弃上清，尽量除尽培养液。 3、加入100μl溶液Ⅰ (配方见附表) 重悬菌体 (剧烈振荡，使菌体分散混匀),室温放置5min。 4、加入新配制的溶液Ⅱ (配方见附表) 200μl，盖紧管口，快速温和颠倒6次(千万不要振荡)，冰浴5 min。
5、加入200μl预冷的溶液Ⅲ (配方见附表) ，盖紧管口，将管温和颠倒数6次混匀，见白色絮状沉淀，在冰上放置5min。
6、4℃，12000rmp离心10min。上清液移入干净EP管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀, 12000rmp离心10min。（500μl的苯酚/氯仿/异戊醇。）
7、小心移出上清于一干净EP管中，加入1ml预冷的无水乙醇，混匀，-20℃放置15min，4℃，12000rmp离心10min。
8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，1ml 70％乙醇洗沉淀两次。 9、 吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。
10、将沉淀溶于20μl 无菌超纯水中，标记好，4℃冰箱保存待电泳观察结果。
11、配制1％琼脂糖凝胶，将称好的琼脂糖粉放入三角烧瓶中，加入1×TBE缓冲液，摇匀后放入微波炉中煮沸三次，凉至不烫手时加入EB（终浓度0.5μg/ml）摇匀，倒入提前插好梳子的胶板槽中，置于平面上待凝。
12、将琼脂糖凝胶放入电泳槽中，加入适量的1×TBE缓冲液，取5μl质粒溶液混入1μl溴酚蓝上样，调整电压(80V，200A)，开始电泳。
13、待样跑至距离凝胶边缘约1厘米时停止电泳，将胶置于紫外成像仪下观察结果。
结果分析
组别:
根据实验质粒电泳条带的位置并对照DNA Marker，绘制质粒图谱并估测质粒分子量大小。（E.coliV517含8个质粒，分别为54.4、7.3、5.6、5.2、4.0、3.0、2.7、2.1kbp）
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结果讨论:
讨论
不同菌株带有分子量相同的质粒，可以认为这些质粒一定是相同的吗？如何进一步验证？
注意事项
EB为致癌剂，本实验中凡是接触到该试剂的操作步骤都应戴PE手套。
附表
（1）溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl (pH8.0) , 10 mmol/L EDTA (pH8.0) , 配制200ml。
取葡萄糖（C6H12O6.H2O）1.982 g，双蒸去离子水160 ml，0.5 mol/L EDTA 4ml，1 mol/L Tris-HCl(pH8.0) 5 ml，定容至200 ml，高压灭菌后4℃保存。 （2）溶液II：0.2 mol/L NaOH, 1%SDS。 配制100 ml，现用现配。
10 mol/L NaOH 2 ml，双蒸去离子水80 ml，10%SDS 10 ml，最后用双蒸去离子水定容至100 ml，室温保存。 （3）溶液III：配制100 ml。
5 mol/L 乙酸钾 60 ml，冰乙酸11.5 ml，双蒸去离子水28.5 ml。
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实验三 综合设计实验
本次实验给出两个题目，学生自选题目并提前预写实验报告，学生可利用网络、图书馆等平台进行资料查找。
题目 一：检测实验室空气中是否存在溶血性链球菌；
题目 二：鉴别菌液，实验室有两瓶不同的菌液，由于操作者疏忽忘记标记名称，现无法区分。已知其中一瓶为金黄色葡萄球菌，另一瓶为铜绿假单胞菌。请设计一个实验帮助该实验者区分开两种菌液；
注：受实验条件限值，请学生设计时要对可行性、可操作性、灵敏度、实验时间、所需成本等方面进行综合考虑。
组 别： 实验题目： 实验原理
所需仪器设备和试剂
试验方法
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预期实验结果分析
实验结果讨论
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