四川大学2015博士学位研究生入学考试试题
代码：3088 科目：微生物学
一、论述题
1.简述埃博拉病毒疫苗研发策略。
答：埃博拉出血热 是由埃博拉病毒 引起的一种高传染性、高致死率的烈性疾病。由于埃博拉病毒的极高危险性和尚无有效的治疗手段，因此该病毒与马尔堡病毒和拉沙病毒同被列为生物安全等级四级 (BSL-4) 病毒，属于最为危险的病原微生物。 目前对埃博拉病毒疫苗研发的策略有：
①传统疫苗：在针对EBOV的传统疫苗研制方面，包括灭火疫苗，减毒活疫苗及传统亚单位疫苗等，目前尚无有发展前途的疫苗。灭火疫苗、减毒活疫苗往往不能有效刺激机体产生免疫保护，且减毒活疫苗还具有潜在的致病风险。
②基因工程疫苗：包括基因工程亚单位疫苗、病毒载体疫苗、DNA疫苗、基因缺失活疫苗和病毒样颗粒疫苗等。
（1）DNA疫苗：限于对DNA疫苗安全性的考虑及免疫刺激活性问题，现有的DNA疫苗导入宿主细胞效率不高，影响了其免疫效率。因此还未见单独将EBOV疫苗应用于非人类灵长类动物的研究报道，不过它有可能与其他载体疫苗配合使用以形成长期免疫保护。 （2）病毒样颗粒疫苗：为不含核酸的空壳结构，其余结构与天然病毒类似，具有很好的免疫原性和生物学活性，但该类疫苗还处于实验探索阶段。
（3）病毒载体疫苗：目前腺病毒载体疫苗vAd3-EBOV和重组水疱型口炎病毒载体疫苗rVSV△G-EBOV-GP成为最具有应用前景的病毒载体疫苗。目前正在进一步将两种疫苗运用于临床试验。
2.简述啤酒酵母中表达分泌型重组蛋白的基本流程。
答：在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白质才能被糖基化。需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。酿酒酵母可以对重组蛋白进行乙酰化修饰，以及没有位点特异性的Ser/Thr磷酸化修饰，还可以进行Asn N-糖基化和Ser/Thr O-糖基化修饰。酿酒酵母的糖基化修饰采用单一的甘露糖残基，N-糖基化修饰由1，3-和1，6-甘露糖残基构成，往往形成40-200个甘露糖残基的较大糖链，通过基因改造可以阻断N-糖基化过程，使糖链缩短为Man8GlcNAc2核心糖链，糖链末端为1,3-甘露糖，使重组蛋白的抗原性明显增强。O-糖基化则由不超过5个的甘露糖残基聚合而成。 基本流程： ①构建载体
前导肽：在重组蛋白的前面加一段编码酵母菌交配类型因子a1的前导肽，与重组蛋白的N端通过Lys-Arg相连。 ②信号肽切割
蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的内切蛋白酶识别这个切点信号，把重组蛋白正确切下来。
Ps：表达外源蛋白的一般步骤为
①目的基因的克隆：选用合适的内切酶把外源基因克隆于表达载体的多克隆位点区 , 如果选用的是分泌型表达载体 , 则外源基因的阅读框架和信号肽的阅读框架应该保持一致。 ②重组载体线性化：重组载体只有被线性化，整合效率才能大大提高 , 环状质粒整合效率是很低的。
③转化：一般用原生质球或电击法。
④筛选：可先利用载体和营养缺陷型菌株的互补性或对抗生素的抗性来进行初筛 , 复筛可用多聚链式反应 (PCR) 。对于大量转化子的筛选 , 可用原位点杂交法进行。用原位点杂交不仅可以筛选大量转化子 , 还可以鉴定多拷贝。
⑤外源蛋白的表达：如果表达载体的启动子是组成型启动子，则表达比较简单；如果载体的启动子是醇诱导型启动子，则外源蛋白的表达分为2步，即菌体生长和蛋白诱导表达。 ⑥放大：表达的条件 ( 如通气状况，pH 值，培养基的组成等) ,经优化以后就可以按比例放大 , 从摇瓶培养转至大规模发酵。
3.简述细菌群体感应在生物学的效应。 答：在特定环境中，细菌产生并向环境中释放特定的细胞外信号分子，随着个体密度的增大，信号分子积累到一定浓度时，会诱发细菌产生独特的、多样的群体行为，这一现象称为细菌的群体感应。群体感应主要有两类：种内特异和种间特异。 革兰氏阴性菌利用具有不同酰基侧链的高丝氨酸内酯，革兰氏阳性菌利用一些小肽作为信号分子来感知种内自身种群数量 , 协调多种基因的表达。还有一类信号分子是一种呋喃硼酸二聚酯 , 即自体诱导子-2（简称 AI - 2) , 它在革兰氏阴性菌和阳性菌中均存在，被用来感知种间细菌数量来调控细菌自身行为。
细菌群体感应机制的功能：群体感应参与细菌种群竞争，孢子生成，抗生素生产，致病因子诱导，细胞分化，致病菌感染过程的营养分配以及其他许多生理反应的调控。 ①许多动植物病原菌通过群体感应调控生物膜的合成，使之适应生存的需要。如人类病原菌 V .cholerae刚进入肠道时，由群体感应调节子HapR调控形成的细胞膜较厚，能很好的适应人肠道内的酸性环境，保护细菌免受胆汁和低p H的影响，维持细菌致病能力。而当 V . cholerae 开始侵染人体时，会通过生成一种自体诱导物合成酶 (CqsA) 抑制胞内多聚糖 (vps)的表达，使 HapR 机制失活，细菌形成的细胞膜变薄 , 以利于侵染宿主。
②群体感应除了参与调节微生物种群的竞争和分化外 , 还参与共生和竞生生物体之间的信息交流。
细菌群体感应相关基因的分析鉴定：细菌群体感应系统调控许多基因的表达，许多基因又参与群体感应系统的调控，分析、鉴定群体感应相关基因对于理解其作用机制和功能发挥具有重要意义。
细菌群体感应的应用： ①病虫害的生物防治。如：苏云金芽孢杆菌 (简称Bt ) 对病原菌的生防能力部分源于它产生的 AHL 2lactonase , 这种酶可水解 AHL 的内酯键 , 使病原菌的群体信号机制失活。
②重组基因的表达。在生物工程领域 , 人们正致力于开发利用群体感应机制控制原核和真核表达系统中蛋白质合成的技术策略。
4.简述宏基因组研究中的直接测序分析策略涉及的主要技术。
答：宏基因组，即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因。目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。 一般包括从环境样品中提取基因组 DNA、克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。 宏基因组测序是指对微生物群体进行高通量测序，分析特定环境中微生物群体基因组成及功能、微生物群体的多样性与丰度，进而分析微生物与环境、微生物与宿主之间的关系，发现具有特定功能的基因。宏基因组测序无需分离纯培养微生物，较大扩展了微生物资源的利用，为环境微生物群落的研究提供了有效工具。宏基因组深度测序可以揭示或估计环境中真实的物种多样性和遗传多样性，挖掘具有应用价值的基因资源，应用于开发新的微生物活性物质。
宏基因组研究分两个方向：扩增子测序和全基因组测序。
5.请你谈谈组学时代的微生物学的可能发展方向和进程。
答：随着信息化时代的到来，我们在生活的方方面面都积累了大量的数据。所谓大数据（Big Data），不仅仅是信息量的巨大，同时也是信息的复杂性和多样性。在这样的时代背景下，微生物学的发展前景是多方面的，比如：微生物基因组学将全面开展；以了解微生物之间、微生物与其他生物、微生物与环境的相互作用为研究内容的微生物生态学，环境微生物学，细胞微生物学等，将在基因组信息的基础上获得长足的发展，为人类的生存和健康发挥积极的作用；微生物生命现象的的特征和贡献将更加受到重视；与其他学科实现更广泛的交叉，获得新的发展；微生物产业将呈现全新的局面。
21世纪微生物基因组学将继续作为“人类基因组计划”的主要模式，在后基因研究（认识基因与基因组功能）中发挥不可取代的作用。在研究重点还会进一步扩大到其他微生物，特别是与健康、人口、环境、资源和工农业有关的重要微生物，并且在从本质上认识微生物自身、利用和改造微生物等方面产生质的飞越，也将带动分子微生物学等基础研究学科的发展。微生物具备生命现象的特性、共性和广泛应用性，将是21世纪进一步解决生物学重大理论问题（如生命的起源与进化，物质运动的基本规律等）和世纪应用问题（如新的微生物资源的开发利用，开发微生物作为能源、粮食等）的最理想的材料。微生物学将进一步向地质、海洋、大气、太空渗透，使更多的边缘学科得到发展，如微生物地球化学、海洋微生物学、大气微生物学、太空（或宇宙）微生物学以及极端环境微生物学等。微生物与能源、信息、材料、计算机的结合也将开辟新的研究和应用领域。微生物的研究技术和方法也会在吸收其他学科的先进技术的基础上，向更加准确、敏感、快速、简便和自动化的方向高速发展。此外，微生物工业将生产各种各样的新产品，例如：降解性塑料、DNA芯片、生物能源等，在21世纪将出现一批新的微生物工业，为全世界的经济和社会发展作出更大贡献。