进行。
46.蛋白质产物可以调节mRNA的降解，如：铁转运蛋白受体（TfR）mRNA稳定性的调节决定于mRNA分子中3′UTR（非编码序列）特定的重复序列，称为铁反应元件（IRE）。
47.细胞内高铁浓度时，IRE可促进TfR mRNA的降解；细胞内铁不足时，IRE结合蛋白破坏TfR mRNA的降解作用，TfR mRNA的寿命延长。
48.微小RNA（miRNA）是由具有发夹结构的约70 ~ 90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后形成的长约21～23个碱基的单链小分子RNA。 49.miRNA与其他蛋白质组成诱导沉默复合体（RISC），通过与靶mRNA分子的3'端非编码区互补匹配，抑制mRNA分子的翻译。
50.干扰小RNA（siRNA）通常是双链RNA（dsRNA），参与RISC组成，与特异的靶mRNA完全互补结合，导致靶mRNA降解阻断翻译过程。称为RNA干涉。 51.siRNA和miRNA的差异比较 前体 结构 功能 生物学效应 单链分子 阻遏其翻译 发育过程的调节 miRNA 内源发夹环结构的转录产物 双链分子 降解mRNA 需完全互补 抑制转座子活性和病毒感染 siRNA 内源或外源长双链RNA诱导产生 靶mRNA结合 不需完全互补 52.RNA结合蛋白（RBP）是指那些能够与RNA特异序列结合的蛋白质，如IRE结合蛋白（IRE-BP）能调节铁蛋白和δ氨基γ酮戊酸(ALA)合酶的合成。 53.IRE位于铁蛋白及ALA合酶mRNA的5′UTR， ①铁浓度低时，IRE-BP结合IRE而阻碍40S小亚基与mRNA5’端起始部位的结合； ②铁浓度高时，铁离子结合IRE-BP，使之不能结合IRE，翻译可以进行。
二十、分子生物学技术
*1.印迹技术 ①将电泳分离的DNA片段变性成为单链； ②将硝酸纤维素（NC）膜放在电泳凝胶上，上置吸水纸，利用毛细作用使胶中的DNA转移到NC膜上； ③将载有DNA单链分子的NC膜放在杂交反应溶液中，溶液中互补DNA结合到NC膜上对应的DNA分子上。
*2.探针（probe）是带有特殊可检测标记的核酸片段，具有特定的序列，能与待测的核酸片段互补结合，可用于检测核酸样品中存在的特定基因。 *3.探针通常用放射性核素、生物素或荧光染料来标记。 4.印迹技术可以分为DNA印迹（Southern）、RNA印迹（Northern）和蛋白质印迹（Western）。 *5.DNA印迹主要步骤： ①样品的制备、酶切；②样品的电泳分离；③DNA碱变性；④转膜；⑤杂交；⑥杂交结果检测。 *6.RNA印迹与DNA印迹相比，无需进行限制性酶切酶消化，电泳结束后不需要变性。 *7.蛋白质印迹又称免疫印迹，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。主要步骤： ①样品的制备；②SDS-PAGE电泳；③电转移； ④与第一抗体、第二抗体分别反应后，用底物显色或放射自显影检测蛋白质区带信号。
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8.另外一些用于核酸和蛋白质分析的技术有斑点印迹、原位杂交、DNA芯片技术、DNA微阵列。
9.PCR技术是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA的过程。
10.PCR反应体系基本成分包括模板DNA、特异引物 、耐热DNA聚合酶、dNTP、含Mg2+的缓冲液。
*11.PCR技术的主要用途 ①目的基因的克隆； ④DNA序列测定； ②基因的体外突变； ⑤基因突变分析。 ③DNA和RNA的微量分析； 12.PCR衍生技术 ①逆转录PCR技术是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。 ②原位PCR是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应。 ③实时PCR技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。
13.实时PCR的基本原理（TaqMan探针法） ①探针5’-末端有荧光报告基因（R基因），3’-端有荧光淬灭基因（Q基因）； ②探针完整时，R和Q基因同时存在于探针上，无荧光信号释放。 ③随着PCR进行，Taq DNA聚合酶将荧光探针逐步切断，R、Q基因一旦分离便产生荧光信号。
14.核酸序列分析方法有：Sanger双脱氧法、化学降解法、焦磷酸测序法
15.Sanger双脱氧法（DNA链的末端合成终止法）在新合成DNA链的3’-末端掺入ddNTP，由于ddNTP的3’-C上缺少羟基不能与下一位核苷酸形成磷酸二酯键，是DNA合成在此处终止。
16.自动荧光DNA测序法是用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应。
17.基因文库是指一个包含了某一生物体全部基因组DNA序列的克隆群体。包括基因组DNA文库和cDNA文库。
18.基因组DNA文库以DNA片段形式贮存生物的基因组DNA信息。
将纯化的细胞基因组DNA用限制酶消化，获得一定大小的DNA片段，将这些片段克隆到噬菌体载体中，获得含有不同DNA片段的噬菌体。
19.以? 噬菌体为载体的人基因组DNA文库的克隆数目至少应该在106个以上，方可认为该文库包含了99%的基因组DNA序列。
20.cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体。
21.克隆数在106以上的cDNA片段才有可能包含来自于细胞内含量很低（低丰度）的mRNA的信息。
22.基因芯片是将许多特定的DNA片段固定在支持物上，然后与标记的样品杂交，再对荧光信号作出检测、比较和分析。
*23.蛋白质芯片是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。
24.蛋白质芯片作用原理是蛋白质分子间的亲和反应，如抗原-抗体、受体-配体间的特异性结合。
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*25.标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。
*26.标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。 27.酵母双杂交技术的基本原理（参考教材P415）。 *28.电泳迁移率变动分析是转录因子研究的经典方法。（原理参考教材P415-416） *29.染色质免疫沉淀技术是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。（原理参考教材P416）
30.克隆疾病相关基因的策略包括功能克隆和定位克隆。
二十一、DNA重组
1.同源重组，又称基本重组，是指发生在同源序列间的重组，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 2.同源重组的4个关键步骤 ①两个同源染色体DNA排列整齐 ②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体 ③通过分支移动产生异源双链DNA ④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA。
3.切开的方式不同，得到不同的重组DNA，分别为片段重组体和拼接重组体 4.切开的链与原来断裂的是同一条链，异源双链区的两侧来自同一亲本DNA，称为片段重组体。
5.切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA，称为拼接重组体。
6.原核细胞可通过接合、转化、转导进行基因转移与重组。
7.接合：当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）。只有某些较大的质粒，如F因子能通过结合方式转移。 8.转化：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。 9.转导：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组。
10.由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合称为位点特异重组。包括：λ噬菌体DNA的整合，细菌的位点特异重组，免疫球蛋白基因的重排。
11.λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合。
12.反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列（LTR）。 13.沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变是细菌的位点特异重组的例子。（有点生硬啊……） 14.免疫球蛋白(Ig)由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(?和?)，一个编码重链。
15.决定轻链的基因簇上有L、V、J、C四类基因片段；决定重链的基因簇上有L、V、D、J、C五类基因片段。
16.由于在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列，因此重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。
17.参与免疫球蛋白基因重排的重组酶基因rag共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。 18.由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座。
19.插入序列由2个反向重复序列及1个转座酶编码基因组成，反向重复序列的侧翼有正向
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重复序列。
20.插入序列发生的转座有保守性转座和复制性转座。
21.转座子由反向重复序列、转座酶编码基因及抗生素抗性等基因组成。 22.限制性核酸内切酶（RE），又称限制酶，能识别DNA的特异序列,，并在识别位点或其周围切割双链DNA。 23.在细菌内，限制性核酸内切酶与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。
24.RE分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三种，但只有Ⅱ型限制酶能在DNA双链内部的特异位点识别和切割DNA。
25.RE的命名由4部分组成： ①第一个字母为自产生该酶的细菌属的词首字母，用大写斜体； ②第二、第三个字母是细菌种的词前两个字母，用小写斜体； ③第四个字母是分离出这种酶的细菌的特定菌株； ④罗马数字表示酶发现的先后顺序。
26.RE的识别序列为回文结构，即两条核苷酸链中，从5’→3’方向的核苷酸序列完全一致。 27.有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍末端。如：Bam H Ⅰ和Bgl Ⅱ。
28.来源不同，但能识别相同的序列，在切割DNA时，其切割位点是相同的，也可以是不同的，这些酶称异源同工酶。如：Bam HⅠ和Bst Ⅰ。 *29.重组DNA技术中常用的工具酶 工具酶 DNA连接酶 DNA聚合酶I Klenow片段 功能 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 ①合成双链cDNA分子或片段连接；②缺口平移制作高比活探针；③DNA序列分析；④填补3′-末端 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5??3?聚合、3??5?外切活性，而无5??3?外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3?末端标记等 ①合成cDNA ；②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针 在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端磷酸基 逆转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶 30.DNA连接酶并不能连接单链的DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。
31.对5?-粘性末端片段，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，在3?–OH端延伸，可填平末端的凹陷并将其转变成钝性末端。
32.对3?粘性末端的片段，应用如T4 DNA聚合酶的3?→5?的核酸外切酶活性可切去未配对的序列，将其转变成钝性末端。
33.载体是为携带目的外源DNA片段，实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。分为克隆载体和表达载体。 34.载体的选择标准 ①能自主复制； ②常具有多克隆位点（MCS）； ③有选择标志或遗传标记物；
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④分子量小，以容纳较大的外源DNA； ⑤可导入受体细胞。
35.作为克隆载体的质粒一般选用松弛型质粒，其复制快于染色体复制。
36.柯斯质粒是一种人工构建的克隆载体，包含了λ噬菌体的cos基因。其所能携带的DNA片段较大（超过45kb）。
37.重组DNA技术包括6个步骤：①目的基因的获取；②载体的选择和构建；③外源基因与载体的连接；④重组DNA导入受体菌；⑤重组体的筛选；⑥克隆基因的表达。概括起来就是：分、选、接、转、筛、表。 38.目的基因的获取的方法： （1）化学合成法
前提是已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。 （2）基因组DNA文库和cDNA文库 （3）PCR
前提是已知待扩增目的基因或DNA片段两端的序列。 39.粘性末端连接 ①同一限制酶或同尾酶切割产生的完全相同的黏性末端，连接后会产生三种结果：载体自连、载体与目的基因连接、目的基因自连。 ②两种不同RE在载体和目的DNA两端分别形成不同的黏性末端，使外源DNA可以定向插入载体。
40.同聚物加尾连接
在末端转移酶的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列（如多聚C）、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 41.衔接物或人工接头连接 ①衔接物：具有一个或数个限制酶识别位点的双链寡核苷酸短片段，等待限制酶切割产生黏性末端。 ②人工接头：一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。
42.作为宿主细胞的条件： ①危害性不大，为安全宿主菌；②限制酶和重组酶基因缺陷；③经处理后能处于感受态。 43.重组DNA导入宿主细胞的方式：转化、转染、感染。 44.重组体的筛选与鉴定 （1）平板筛选 ①利用抗药性基因插入失活（参考教材P430） ②蓝-白筛选（α互补）（参考教材P431） ③标志补救
（2）限制酶切图谱鉴定 （3）PCR筛选重组体
（4）核酸分子杂交技术（参考教材P432） 45.外源基因表达的三个条件： ①基因的编码区不能含插入序列； ②基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主细胞的RNA聚合酶识别； ③mRNA必须相当稳定，并能有效地被翻译，产生的外源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶降解。
46.原核表达体系的标准：
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①选择标志；②具有强启动子；③翻译调控序列；④有合理设计的多接头克隆位点。 47.E.coli表达体系的不足 ①不宜表达真核基因组DNA； ②不能加工表达的真核蛋白质； ③表达的蛋白质常形成不溶性包涵体； ④很难表达大量可溶性蛋白。 48.真核表达体系 ①可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA； ②可适当修饰表达的蛋白质； ③表达产物分布在细胞内一定区域并积累。
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